સમાચાર

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ ધરાવે છે.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).આ દરમિયાન, સતત સમર્થન સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટને રેન્ડર કરીશું.
કેન્સર કોષોએ સેલ્યુલર તણાવને દૂર કરવા અને પ્રગતિ ચાલુ રાખવા માટે વિવિધ પદ્ધતિઓ વિકસાવી છે.પ્રોટીન કિનેઝ આર (PKR) અને તેના પ્રોટીન એક્ટિવેટર (PACT) એ પ્રારંભિક પ્રતિસાદકર્તા છે જે કોષોના પ્રસાર અને એપોપ્ટોસિસના અવરોધ તરફ દોરી જતા વિવિધ તાણ સંકેતોનું નિરીક્ષણ કરે છે.જો કે, કેન્સર કોષોમાં PACT-PKR પાથવેનું નિયમન મોટે ભાગે અજ્ઞાત છે.અહીં, અમને જાણવા મળ્યું કે લાંબા નોન-કોડિંગ RNA (lncRNA) aspartyl tRNA સિન્થેટેઝ એન્ટિસેન્સ RNA 1 (DARS-AS1) PACT-PKR પાથવેના નિષેધમાં સીધો સામેલ છે અને કેન્સર સેલ પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે.CRISPRi 971 કેન્સર-સંબંધિત lncRNA ના મોટા પાયે કાર્યાત્મક સ્ક્રીનીંગનો ઉપયોગ કરીને, અમે શોધી કાઢ્યું કે DARS-AS1 નોંધપાત્ર રીતે ઉન્નત કેન્સર સેલ પ્રસાર સાથે સંકળાયેલું હતું.તેથી, DARS-AS1 નોકઆઉટ સેલ પ્રસારને અટકાવે છે અને વિટ્રોમાં વિવિધ કેન્સર સેલ લાઇનમાં કેન્સર સેલ એપોપ્ટોસિસને પ્રોત્સાહન આપે છે અને વિવોમાં ગાંઠની વૃદ્ધિને નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડે છે.યાંત્રિક રીતે, DARS-AS1 સીધા PACT સક્રિયકરણ ડોમેન સાથે જોડાય છે અને PACT-PKR ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને અટકાવે છે, ત્યાં PKR સક્રિયકરણ, eIF2α ફોસ્ફોરાયલેશન ઘટાડે છે અને એપોપ્ટોટિક સેલ મૃત્યુને અટકાવે છે.તબીબી રીતે, DARS-AS1 બહુવિધ કેન્સરમાં વ્યાપકપણે વ્યક્ત થાય છે, અને આ lncRNA ની વધુ પડતી અભિવ્યક્તિ નબળા પૂર્વસૂચનનું સૂચક છે.આ અભ્યાસ DARS-AS1 lncRNA દ્વારા PACT-PKR પાથવેના કેન્સર-વિશિષ્ટ નિયમનને સ્પષ્ટ કરે છે અને કેન્સર પૂર્વસૂચન અને સારવાર માટે બીજું લક્ષ્ય પૂરું પાડે છે.
તણાવ સાથે અનુકૂલન કરવાની ક્ષમતા એ કેન્સર સેલના અસ્તિત્વ અને પ્રસારની એક મહત્વપૂર્ણ લાક્ષણિકતા છે.કઠોર સૂક્ષ્મ વાતાવરણમાં કેન્સરની ટોચનું ઝડપી પ્રસાર અને મેટાબોલિક હોલમાર્ક - પોષક તત્ત્વોની ઉણપ, હાયપોક્સિયા અને નીચા pH - જે સેલ ડેથ સિગ્નલિંગ પાથવેઝને ટ્રિગર કરી શકે છે.તણાવ-સંવેદનશીલ જનીનો જેમ કે p535, હીટ શોક પ્રોટીન 6, 7, KRAS8, 9, અને HIF-110, 11, 12, 13નું અસંયમ કેન્સરમાં વારંવાર જોવા મળે છે, ત્યાં એપોપ્ટોસિસને અવરોધે છે અને અસ્તિત્વને પ્રોત્સાહન આપે છે.
પ્રોટીન કિનેઝ આર (PKR) એ યુકેરીયોટિક ઇનિશિયેશન ફેક્ટર 2α (eIF2α) નું એક મહત્વપૂર્ણ સ્ટ્રેસ સેન્સર અને સબ્યુનિટ કિનેઝ છે, જે ટ્રાન્સલેશનલ રેગ્યુલેટર છે જે સેલ્યુલર સ્ટ્રેસને સેલ ડેથ સાથે જોડે છે.વિદેશી ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ RNA (dsRNA) ની શોધ દ્વારા PKR ને મૂળરૂપે એન્ટિવાયરલ પ્રોટીન તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું હતું.સક્રિય થવા પર, PKR ફોસ્ફોરીલેટ્સ eIF2α વાયરલ અને સેલ્યુલર પ્રોટીન સંશ્લેષણ 14,15,16 ને અટકાવે છે.PACT (PKR એક્ટિવેટર પ્રોટીન) ને dsRNA17,18,19,20,21,22,23 ની ગેરહાજરીમાં પ્રથમ PKR એક્ટિવેટર પ્રોટીન તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું છે.PKR સાથે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા, PACT વિવિધ તાણ (સીરમ ભૂખમરો, પેરોક્સાઇડ અથવા આર્સેનાઈટ ટ્રીટમેન્ટ)ને PKR અને ડાઉનસ્ટ્રીમ સિગ્નલિંગ પાથવેમાં ટ્રાન્સડ્યુસ કરે છે.eIF2α ફોસ્ફોરીલેશન ઉપરાંત, PACT-મધ્યસ્થી PKR સક્રિયકરણ તણાવ પ્રતિભાવ સાથે સંકળાયેલી વિવિધ ઘટનાઓને ટ્રિગર કરે છે, જેમાં PI3K/Akt24 પાથવે દ્વારા બદલાયેલ રેડોક્સ સ્થિતિ, p5325,26 અને NF-κB27,28 દ્વારા ઉન્નત ડીએનએ નુકસાનની તપાસ, ટ્રાન્સક્રિપ્શન, 29નું નિયમન કરે છે. તણાવ પ્રતિભાવ, પ્રસાર, એપોપ્ટોસિસ અને અન્ય મુખ્ય સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓમાં તેમની મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકાને જોતાં, PKR અને PACT ઘણા રોગો, ખાસ કરીને કેન્સર30,31,32,33 માટે આશાસ્પદ ઉપચારાત્મક લક્ષ્યો છે.જો કે, આ પ્લિયોટ્રોપિક કાર્યાત્મક અને જૈવિક મહત્વ હોવા છતાં, કેન્સર કોષોમાં PACT/PKR પ્રવૃત્તિનું નિયમન પ્રપંચી રહે છે.
lncRNA એ 200 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ કરતાં મોટી ટ્રાન્સક્રિપ્ટ છે જેમાં પ્રોટીન-કોડિંગ સંભવિત નથી.અદ્યતન સંપૂર્ણ જીનોમ સિક્વન્સિંગ પ્રોજેક્ટ્સે હજારો lncRNAs ઓળખી કાઢ્યા હોવાથી, તેમના જૈવિક કાર્યોને સ્પષ્ટ કરવા માટે 35,36 ઘણા પ્રયત્નો કરવામાં આવ્યા છે.સંશોધનની વધતી જતી સંસ્થાએ દર્શાવ્યું છે કે lncRNAs ઘણી જૈવિક પ્રક્રિયાઓમાં સામેલ છે, જેમાં X-રંગસૂત્ર નિષ્ક્રિયકરણના નિયમનનો સમાવેશ થાય છે38,39, છાપ 40, ટ્રાન્સક્રિપ્શન41,42, અનુવાદ43 અને કેન્સરની વૃદ્ધિ44,45,46,47.આ અભ્યાસોએ અહેવાલ આપ્યો છે કે ઘણા lncRNAs PACT/PKR પાથવેમાં સામેલ છે.આવા એક અભ્યાસ દર્શાવે છે કે lncRNA ASPACT એ PACT ટ્રાન્સક્રિપ્શનને અવરોધે છે અને PACT mRNA ની પરમાણુ રીટેન્શનમાં વધારો કર્યો છે.અન્ય અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે lncRNA nc886 PKR સાથે જોડાય છે અને તેના ફોસ્ફોરાયલેશન 49,50 ને અટકાવે છે.અત્યાર સુધી, PACT- મધ્યસ્થી PKR સક્રિયકરણનું નિયમન કરતી lncRNA ની જાણ કરવામાં આવી નથી.
Aspartyl-tRNA સિન્થેટેઝ એન્ટિસેન્સ RNA 1 (DARS-AS1) ની ઓળખ ઓન્કોજેનિક lncRNA51,52,53,54 તરીકે કરવામાં આવી છે.miP-194-5p53, miP-12952 અને miP-532-3p51 ના નિયમન દ્વારા, DARS-AS1 એ અનુક્રમે ક્લિયર સેલ રેનલ સેલ કાર્સિનોમા, થાઇરોઇડ કાર્સિનોમા અને નોન-સ્મોલ સેલ લંગ કાર્સિનોમાના વિકાસને પ્રોત્સાહન આપવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું છે.ટોંગ અને સહકર્મીઓએ એ પણ શોધી કાઢ્યું હતું કે DARS-AS1 પ્રોટીન 39 (RBM39) RNA-બંધનકર્તા મોટિફની સ્થિરતા જાળવીને માયલોમાની પ્રગતિને પ્રોત્સાહન આપે છે.જો કે, આ lncRNA PACT-PKR સક્રિયકરણના નિયમન અને કેન્સર કોષોના તણાવ પ્રતિભાવમાં સામેલ છે કે કેમ તે અંગે કોઈ અભ્યાસ હાથ ધરવામાં આવ્યો નથી.
અહીં, અમે CRISPRi સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને મોટા પાયે નુકસાન-ઓફ-ફંક્શન સ્ક્રીન પરફોર્મ કર્યું અને નક્કી કર્યું કે DARS-AS1 lncRNA અનેક પ્રકારના કેન્સર કોષોના પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે.વધુમાં, અમે એક મુખ્ય મિકેનિઝમ ઓળખી કાઢ્યું છે: DARS-AS1 સીધા PACT સાથે જોડાય છે, PACT અને PKR બંધનને અટકાવે છે, eIF2α, નીચલા PKR સબસ્ટ્રેટના ફોસ્ફોરાયલેશનને અટકાવે છે અને આખરે એપોપ્ટોટિક સેલ મૃત્યુને અટકાવે છે.નિષ્કર્ષમાં, અમારું કાર્ય DARS-AS1 lncRNA ને PACT-PKR પાથવેના નિયમનકાર તરીકે અને કેન્સરની સારવાર અને પૂર્વસૂચન માટે સંભવિત લક્ષ્યને દર્શાવે છે.
વ્યાપક જીનોમિક પ્રોફાઇલિંગ અભ્યાસોએ કેન્સર સાથે સંકળાયેલા સેંકડો lncRNA ને ઓળખ્યા છે.જો કે, તેમનું કાર્ય મોટે ભાગે અજ્ઞાત છે56.કેન્સરની પ્રગતિમાં સામેલ આશાસ્પદ lncRNA ઉમેદવારોને ઓળખવા માટે, અમે CRISPRi સિસ્ટમ (ફિગ. 1a) નો ઉપયોગ કરીને SW620 કોલોરેક્ટલ કેન્સર સેલ લાઇનમાં ઓછા પ્રસાર માટે લોસ-ઓફ-ફંક્શન સ્ક્રીન કરી હતી.SW480 અને SW620 કોલોન કેન્સર સેલ લાઇનની વિશિષ્ટ વિશેષતા એ છે કે તે એક દર્દીમાં પ્રાથમિક અને ગૌણ ગાંઠોમાંથી મેળવવામાં આવે છે.આ અદ્યતન કોલોન કેન્સરની પ્રગતિમાં આનુવંશિક ફેરફારોનો અભ્યાસ કરવા માટે મૂલ્યવાન સરખામણી પૂરી પાડે છે.તેથી, અમે RNA સિક્વન્સિંગનો ઉપયોગ કરીને કોલોરેક્ટલ કેન્સર સેલ લાઇન્સ (SW480 અને SW620) ના ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ્સનું વિશ્લેષણ કર્યું અને પ્રકાશિત સાહિત્યમાંથી કેટલાક સંભવિત કાર્યાત્મક lncRNAs એકત્રિત કર્યા.આ પરિણામોના આધારે, અમે નકારાત્મક નિયંત્રણ (પૂરક ડેટા 1) માટે 971 કેન્સર-સંબંધિત lncRNAs અને 500 બિનલક્ષિત sgRNA ઓલિગોને લક્ષ્યાંકિત કરતી 7355 sgRNA ઓલિગો ધરાવતી પૂલ કરેલી sgRNA લાઇબ્રેરી ડિઝાઇન કરી છે.
CRISPRi સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને સ્ક્રીનીંગની યોજનાકીય રજૂઆત.b સ્ક્રીનીંગ પછી sgRNA સંવર્ધન.આડી ડોટેડ લાઇન લોગ2 (ફોલ્ડ ચેન્જ) = ±0.58 દર્શાવે છે.ઊભી ડોટેડ રેખા p મૂલ્ય = 0.05 સૂચવે છે.કાળા બિંદુઓ બિન-લક્ષ્ય sgRNA (NC તરીકે નિયુક્ત) નું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.લાલ બિંદુઓ DARS-AS1 ને લક્ષ્યાંકિત કરતી sgRNAs છે.વાદળી બિંદુઓ એ LINC00205 ને લક્ષ્યાંકિત કરતી sgRNAs છે, જે અગાઉ વર્ણવેલ ઓન્કોજેનિક lncRNA છે.ફોલ્ડ ચેન્જ = (સામાન્ય વાંચન, દિવસ 17)/(સામાન્ય વાંચન, દિવસ 0).c DARS-AS1 sgRNA નોકડાઉન સેલ વૃદ્ધિને અટકાવે છે.એરર બાર ત્રણ પ્રયોગોના ± પ્રમાણભૂત વિચલનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ.d DARS-AS1 ગાંઠોમાં અભિવ્યક્તિ (TCGA ડેટાસેટ).BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, અને COAD, અનુક્રમે (TCGA ડેટાસેટ) ધરાવતા દર્દીઓના જોડીવાળા સામાન્ય અને ગાંઠના નમૂનાઓમાં DARS-AS1 ની અભિવ્યક્તિ.પી-મૂલ્યો જોડી બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવ્યા હતા.
પ્લાઝમિડ બનાવ્યા પછી અને લેન્ટીવાયરસનું પેકેજિંગ કર્યા પછી, અમે ઉપરોક્ત લાઇબ્રેરી સાથે dCas9-SW620 કોલોરેક્ટલ કેન્સર સેલ લાઇનને ચાર સ્વતંત્ર ચેપ પ્રયોગોમાં ટ્રાન્સડ્યુસ કર્યું.આ ચેપ માટે મલ્ટીપ્લીસીટી ઓફ ઈન્ફેક્શન (MOI) 0.1–0.3 હતી, જે દર્શાવે છે કે દરેક કોષ માત્ર એક sgRNA વડે ટ્રાન્સફેક્ટ થઈ શકે છે.ઈન વિટ્રો કલ્ચરના 18 દિવસ પછી, સ્ક્રિનિંગ પછી લક્ષ્ય sgRNAs ની સંવર્ધન પ્રોફાઇલમાં ઘટાડો થયો અથવા વધારો થયો, જ્યારે બિન-લક્ષિત નિયંત્રણ ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સની સંખ્યા પૂર્વ-સ્ક્રીનિંગ પ્રોફાઇલની તુલનામાં પ્રમાણમાં યથાવત રહી, જે દર્શાવે છે કે અમારું લક્ષ્ય ઉચ્ચ સ્ક્રીન-વિશિષ્ટ છે. પુસ્તકાલય.ચોખા.1b અને પૂરક કોષ્ટક 1). LINC00205, જે અગાઉ ફેફસાના કેન્સર અને યકૃતના કેન્સરની પ્રગતિ58,59,60 ને પ્રોત્સાહન આપવા માટે નોંધવામાં આવ્યું હતું, તેની તપાસ કરવામાં આવી હતી (લોગ2 (ફોલ્ડ ચેન્જ) < −0.58, p મૂલ્ય < 0.05), આ સ્ક્રીનીંગની વિશ્વસનીયતાની પુષ્ટિ કરે છે (ફિગ. 1b). LINC00205, જે અગાઉ ફેફસાના કેન્સર અને યકૃતના કેન્સરની પ્રગતિ58,59,60 ને પ્રોત્સાહન આપવા માટે નોંધવામાં આવ્યું હતું, તેની તપાસ કરવામાં આવી હતી (લોગ2 (ફોલ્ડ ચેન્જ) < −0.58, p મૂલ્ય < 0.05), આ સ્ક્રીનીંગની વિશ્વસનીયતાની પુષ્ટિ કરે છે (ફિગ. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, અગાઉ ફેફસાના કેન્સર અને યકૃતના કેન્સરની પ્રગતિને પ્રોત્સાહન આપવા માટે જાણ કરવામાં આવી હતી58,59,60, બાકાત રાખવામાં આવી હતી (લોગ2 (ફોલ્ડ ચેન્જ) <-0.58, p-વેલ્યુ <0.05), આ સ્ક્રીનીંગની મજબૂતતાની પુષ્ટિ કરે છે (ફિગ. .1b) . Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （લોગ 2 （（变化 变化）））））））） Linc00205 之前 被 报道 可 促进 肺癌 和 肝癌 进展 进展 进展 58,59,60 ， 被 筛 选 掉 （લોગ 2 （（变化 变化）））））））） LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205, અગાઉ ફેફસાં અને યકૃતના કેન્સરની પ્રગતિને પ્રોત્સાહન આપવા માટે જાણ કરવામાં આવી હતી58,59,60, બાકાત રાખવામાં આવી હતી (લોગ2 (ફોલ્ડ ચેન્જ) <-0.58, p-વેલ્યુ <0.05), આ સ્ક્રીનીંગની મજબૂતાઈની પુષ્ટિ કરે છે (ફિગ. .1b).
પરીક્ષણ કરાયેલા તમામ lncRNAs પૈકી, DARS-AS1 પણ તપાસવામાં આવ્યું હતું, જેમાં ત્રણ કોગ્નેટ sgRNA ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ 18 દિવસની સંસ્કૃતિ પછી નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડી દેવામાં આવ્યા હતા, જે સૂચવે છે કે આ lncRNA ના નોકડાઉનથી કેન્સરના પ્રસારમાં ઘટાડો થયો છે (ફિગ. 1b).આ પરિણામને કોલોરેક્ટલ કેન્સર કોશિકાઓમાં MTS વિશ્લેષણ દ્વારા વધુ સમર્થન આપવામાં આવ્યું હતું જે દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નોકડાઉન કોશિકાઓનો વિકાસ દર નિયંત્રણ કોષો (આકૃતિ 1c) ની સરખામણીમાં માત્ર અડધો હતો અને તે અન્ય ઘણા પ્રકારના કેન્સરના અગાઉના અહેવાલો સાથે સુસંગત હતો.: સ્પષ્ટ સેલ કિડની કેન્સર, થાઇરોઇડ કેન્સર અને નોન-સ્મોલ સેલ લંગ કેન્સર51,52,53,55.જો કે, કોલોરેક્ટલ કેન્સરમાં તેનું કાર્ય અને મોલેક્યુલર મિકેનિઝમ્સ અન્વેષિત રહે છે.તેથી, અમે વધુ અભ્યાસ માટે આ lncRNA પસંદ કર્યું.
દર્દીઓમાં DARS-AS1 અભિવ્યક્તિનો અભ્યાસ કરવા માટે, અમે કેન્સર જીનોમ એટલાસ (TCGA) પ્રોજેક્ટમાંથી 10,327 ગાંઠના નમૂનાનું વ્યાપકપણે વિશ્લેષણ કર્યું.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે કોલોન એડેનોકાર્સિનોમા (COAD), રેનલ ક્લિયર સેલ કાર્સિનોમા (KIRC), અને રેનલ પેપિલરી સેલ કાર્સિનોમા (KIRP) સહિત વિવિધ ગાંઠોમાં DARS-AS1 વ્યાપકપણે વ્યક્ત અને નોંધપાત્ર રીતે તંદુરસ્ત કોષોમાં અપરેગ્યુલેટ થયેલ છે..બહુ ઓછા (ફિગ. 1d અને પૂરક ફિગ. 1a, b). જોડી બનાવેલા સ્વસ્થ/ગાંઠના નમૂનાઓના વિશ્લેષણે મૂત્રાશય યુરોથેલિયલ કાર્સિનોમા (BLCA), કિડની રેનલ ક્લિયર સેલ કાર્સિનોમા (KIRC), પ્રોસ્ટેટ એડેનોકાર્સિનોમા (PRAD), ફેફસાના સ્ક્વામસ સેલ કાર્સિનોમા (LUSC) ની ગાંઠોમાં DARS-AS1 ની વધુ ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ કરી. , ગર્ભાશય કોર્પસ એન્ડોમેટ્રાયલ કાર્સિનોમા (UCEC), ફેફસાના એડેનોકાર્સિનોમા (LUAD), લીવર હેપેટોસેલ્યુલર કાર્સિનોમા (LIHC), કિડની રેનલ પેપિલરી સેલ કાર્સિનોમા (KIRP), અને કોલોન એડેનોકાર્સિનોમા (COAD) (p મૂલ્ય < 0.05) (ફિગ. 1e) . જોડી બનાવેલા સ્વસ્થ/ગાંઠના નમૂનાઓના વિશ્લેષણે મૂત્રાશય યુરોથેલિયલ કાર્સિનોમા (BLCA), કિડની રેનલ ક્લિયર સેલ કાર્સિનોમા (KIRC), પ્રોસ્ટેટ એડેનોકાર્સિનોમા (PRAD), ફેફસાના સ્ક્વામસ સેલ કાર્સિનોમા (LUSC) ની ગાંઠોમાં DARS-AS1 ની વધુ ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ કરી. , ગર્ભાશય કોર્પસ એન્ડોમેટ્રાયલ કાર્સિનોમા (UCEC), ફેફસાના એડેનોકાર્સિનોમા (LUAD), લીવર હેપેટોસેલ્યુલર કાર્સિનોમા (LIHC), કિડની રેનલ પેપિલરી સેલ કાર્સિનોમા (KIRP), અને કોલોન એડેનોકાર્સિનોમા (COAD) (p મૂલ્ય < 0.05) (ફિગ. 1e) .જોડી બનાવેલા સ્વસ્થ/ગાંઠના નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ પણ મૂત્રાશય યુરોથેલિયલ કાર્સિનોમા (BLCA), ક્લિયર સેલ રેનલ અને રેનલ સેલ કાર્સિનોમા (KIRC), પ્રોસ્ટેટ એડેનોકાર્સિનોમા (PRAD), ફેફસાના સ્ક્વામસ સેલ કાર્સિનોમા (LUSC) ગાંઠોમાં DARS-AS1 ની નોંધપાત્ર રીતે ઉચ્ચ અભિવ્યક્તિની પુષ્ટિ કરે છે., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– મી). , કોર્પસ ગર્ભાશય (UCEC) ના એન્ડોમેટ્રાયલ કાર્સિનોમા, ફેફસાના એડેનોકાર્સિનોમા (LUAD), યકૃતના હિપેટોસેલ્યુલર કાર્સિનોમા (LIHC), કિડનીના પેપિલરી સેલ કાર્સિનોમા (KIRP), અને કોલોન (COAD) ના એડેનોકાર્સિનોમા (પી મૂલ્ય < 0.05) (ફિગ. 1e–m) .配对 健康/肿瘤样本 的 分析 证实 了 dars-as1 在 膀胱 尿路 上 皮癌. <0.05）（图1e-m） .配 对 健康/肿瘤样本 的 证实 了 了 DARS-OS1 在 上 皮癌 皮癌 皮癌 皮癌 、 肾 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 腺腺癌 腺腺癌.癌 (kirp）) （coad） (p 值<0.05）） (图1e-m）) .તંદુરસ્ત/ટ્યુમર જોડી નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ મૂત્રાશય યુરોથેલિયલ કાર્સિનોમા (BLCA), ક્લિયર સેલ રેનલ સેલ કાર્સિનોમા (KIRC), પ્રોસ્ટેટ એડેનોકાર્સિનોમા (PRAD), અને ફેફસાના સ્ક્વામસ સેલ કાર્સિનોમા (LUSC) ગાંઠોમાં DARS-AS1 ની ભૂમિકાને વધુ સમર્થન આપે છે.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). કોર્પસ ગર્ભાશય કાર્સિનોમા (UCEC), ફેફસાના એડેનોકાર્સિનોમા (LUAD), હેપેટોસેલ્યુલર કાર્સિનોમા (LIHC), રેનલ પેપિલરી સેલ કાર્સિનોમા (KIRP), અને કોલોન એડેનોકાર્સિનોમા (COAD) (p મૂલ્ય <0.05) (આકૃતિ 1e -m) માં અભિવ્યક્તિ.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 વિવિધ પ્રકારના કેન્સરમાં વ્યાપકપણે અને ખૂબ જ વ્યક્ત થાય છે.
કારણ કે DARS-AS1 અને DARS (એન્ટિસેન્સ સ્ટ્રૅન્ડને એન્કોડ કરતું જનીન) સમાન પ્રમોટર શેર કરે છે અને એકબીજાની બાજુમાં સ્થિત છે, અમે shRNA ને ખાસ કરીને DARS-AS1 ને નોકડાઉન કરવા માટે ડિઝાઇન કર્યું છે પરંતુ DARS નહીં (પૂરક ફિગ. 2a,b અને પૂરક કોષ્ટક 2) .SW620 ઉપરાંત, અમે shRNA નોકડાઉન (પૂરક કોષ્ટક 3) ની અસરકારકતા અને કાર્યનો અભ્યાસ કરવા માટે DARS-AS1 ને ઉચ્ચ રીતે વ્યક્ત કરતી ત્રણ અન્ય સેલ લાઇનનો પણ ઉપયોગ કર્યો છે.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે વિકસિત થયેલ ત્રણેય shRNA એ ઓછામાં ઓછી 80% DARS-AS1 નોકડાઉન કાર્યક્ષમતા પ્રાપ્ત કરી છે જેમાં DARS mRNA (પૂરક ફિગ. 2c–f) ની માત્રા પર થોડી અસર પડી છે.વધુમાં, અમને જાણવા મળ્યું છે કે આ shRNAs સાથે DARS-AS1 નોકડાઉન કોલોરેક્ટલ કેન્સર સેલ લાઇન SW620 (49.7%) અને HCT116 (27.7%), સ્તન કેન્સર સેલ લાઇન MBA-MD-231 (53.4%) માં સેલ વૃદ્ધિને નોંધપાત્ર રીતે અટકાવે છે.) અને HepG2 હેપેટોમા સેલ લાઇન (92.7% ઘટાડો), તેમજ અનએન્કોર્ડ ગોળાઓ બનાવવાની તેમની ક્ષમતા (~50.8%, 44.6%, 40.7% અને 75.7% પ્રતિ સેલ લાઇનનો સરેરાશ ઘટાડો) (ફિગ. 2a,b).SW620 માં, વસાહત રચના પરીક્ષાના પરિણામોએ વધુ પુષ્ટિ કરી કે DARS-AS1 shRNA એ લગભગ 69.6% (ફિગ. 2c) ની સરેરાશ ઘટાડાની સાથે સેલ પ્રસારને નોંધપાત્ર રીતે અટકાવ્યું.
SW620, HCT116, MBA-MD-231 અને HepG2 કોષોમાં સેલ પ્રસાર (a) અને ગોળાકાર રચના (b) પર નિયંત્રણ shRNA અને DARS-AS1 shRNA ની અસર.c નિયંત્રણ shRNA અને DARS-AS1 shRNA ની અસર SW620 કોષોમાં વસાહત રચના પર.કોષ પ્રસાર (d), ગોળાકાર રચના (e), અને SW620 કોષોની વસાહત રચના (f) DARS-AS1 ને વધારે પડતી અસર કરે છે.દર્શાવેલ ડેટા એ ત્રણ પ્રયોગોનું સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન છે.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, અને *** p ≤ 0.001 બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ દ્વારા.
ખોટ-ઓફ-ફંક્શન અભ્યાસોને પૂરક બનાવવા માટે, અમે આગળ DARS-AS1 (પૂરક ફિગ. 2g) ને વધારે પડતા SW620 કોષો બનાવ્યા.DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેસન એ SW620 કોશિકાઓમાં કોષની વૃદ્ધિ (1.8-ગણો), અનએન્કોર્ડ સ્ફેરોઇડ રચના (1.4-ગણો), અને કોલોની રચના (3.3-ગણો) નોંધપાત્ર રીતે વધારી છે (ફિગ. 2d–f).અમે અન્ય DARS-AS1 એક્સપ્રેસિંગ સેલ લાઇન, A549 નો ઉપયોગ કરીને આ પરિણામની પુષ્ટિ કરી છે.DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેશનને કારણે આ ઉન્નત સેલ પ્રસારણ A549 કોષોમાં વધુ જોવા મળ્યું હતું (પૂરક ફિગ. 2h, i અને પૂરક કોષ્ટક 3).એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ લાભ અને નુકસાનના અભ્યાસો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 વિટ્રોમાં કેન્સર સેલ પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે.
DARS-AS1 કોષના પ્રસારને નિયંત્રિત કરે છે તે અંતર્ગત પદ્ધતિનું અન્વેષણ કરવા માટે, અમે તેના સંભવિત પ્રોટીન-બંધનકર્તા ભાગીદારોને ઓળખવા માટે RNA પુલ-ડાઉન વિશ્લેષણ કર્યું.RT-qPCR પરિણામો દર્શાવે છે કે લગભગ 86.2% DARS-AS1 SW620 કોષોના સાયટોપ્લાઝમમાં સ્થિત છે (પૂરક ફિગ. 3a).ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્ટેડ બાયોટીનિલેટેડ DARS-AS1 અથવા સ્યુડોઆરએનએ પછી SW620 સેલ લાઇસેટ્સ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ SDS-PAGE અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.અનુગામી સિલ્વર સ્ટેનિંગ દર્શાવે છે કે એક અલગ બેન્ડ (~38 kDa) DARS-AS1 પુલ નમૂનાઓમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતું પરંતુ બનાવટી RNA અથવા માળખાના નમૂનાઓ (ફિગ. 3a) માં નહીં.આ બેન્ડને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (MS) દ્વારા PKR એક્ટિવેટીંગ પ્રોટીન (PACT) તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું હતું અને SW620, HCT116, અને HepG2 સેલ લાઇન (ફિગ. 3a,b) માં ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા વધુ પુષ્ટિ મળી હતી.DARS અને સંબંધિત PACT પ્રોટીન - PKR અને TRBP - ના સંવર્ધનની પણ વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ (WB) દ્વારા RNA વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને તપાસ કરવામાં આવી હતી.પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 RNA અને આ ત્રણ પ્રોટીન વચ્ચે કોઈ સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા જોવા મળી નથી (પૂરક ફિગ. 3b).DARS-AS1 અને PACT વચ્ચેની વિશિષ્ટ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની વધુ RNA ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (RIP) વિશ્લેષણ દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી, જે દર્શાવે છે કે DARS-AS1 એન્ટી-PACT એન્ટિબોડીઝમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ હતું પરંતુ અન્ય નિયંત્રણ RNAs (આકૃતિ 3c) માં નહીં.અન્ય સેલ્યુલર ઘટકોની ગેરહાજરીમાં DARS-AS1 PACT સાથે સીધો સંપર્ક કરે છે કે કેમ તે નિર્ધારિત કરવા માટે, શુદ્ધ PACT નો ઉપયોગ કરીને ઇન વિટ્રો બાયોલેયર ઇન્ટરફેરોમેટ્રી (BLI) એસે કરવામાં આવી હતી.બાયોટિન-લેબલવાળી DARS-AS1 અથવા બનાવટી RNA સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન (SA) બાયોસેન્સર્સ પર સ્થિર કરવામાં આવી હતી અને પછી 1 μM PACT ધરાવતા કાઇનેટિક બફરમાં ઉકાળવામાં આવી હતી.નોંધનીય રીતે, PACT DARS-AS1 (KD મૂલ્ય ~26.9 nM) સાથે મજબૂત રીતે બંધાયેલું છે, પરંતુ RNA (આકૃતિ 3d) ની નકલ કરતું નથી.સાથે મળીને, આ પરિણામો DARS-AS1 અને PACT વચ્ચે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા અને ઉચ્ચ સંબંધ દર્શાવે છે.
RNA પુલ વિશ્લેષણે SW620 કોષોમાં PACT સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા DARS-AS1 ઓળખી કાઢ્યું.ઉપર, સંબંધિત પ્રોટીનના ચાંદીના સ્ટેનિંગ.લોઅર ઇમ્યુનોબ્લોટ્સ એન્ટી-PACT એન્ટિબોડી સાથે કરવામાં આવ્યા હતા.b RNA પુલ-ડાઉન વિશ્લેષણ HCT116 (ટોચ) અને HepG2 (નીચે) કોષોમાં કરવામાં આવ્યું હતું.ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા PACT સંવર્ધન શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું.દર્શાવેલ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને SW620 કોષોમાં cRNA ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (RIP) એસેસ કરવામાં આવ્યા હતા.બાયોલેયર ઇન્ટરફેરોમેટ્રી (BLI) નો ઉપયોગ કરીને પૂર્ણ-લંબાઈના DARS-AS1 અથવા નિયંત્રણ RNA માટે PACT બંધનકર્તા વળાંક મેળવવામાં આવ્યા હતા.આરએનએ સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન બાયોસેન્સર પર સ્થિર હતું.એસોસિએશનને માપવા માટે 1 μM PACT નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.e RNA પુલ એસે બાયોટીનીલેટેડ પૂર્ણ-લંબાઈના DARS-AS1 અથવા કાપેલા (ટોપ) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી.ઇમ્યુનોબ્લોટ PACT પ્રાપ્ત દર્શાવે છે (નીચે).f પ્યુરિફાઇડ ફ્લેગ કરેલ PACT ને બાયોટીનીલેટેડ ફુલ-લેન્થ ડીએઆરએસ-એએસ1 સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું અથવા ઇન વિટ્રો RIP એસે માટે કાપવામાં આવ્યું હતું (e માં).કાઢવામાં આવેલ RNA RT-qPCR દ્વારા ચકાસવામાં આવ્યું હતું.g PACT માટે વિવિધ આરએનએ ટુકડાઓની સાપેક્ષતા બાયોલેયર ઇન્ટરફેરોમેટ્રીનો ઉપયોગ કરીને મેળવવામાં આવી હતી.વિશ્લેષણ માટે, 100 nM RNA અને 1 μM RAST નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.h ઇન વિટ્રો આરઆઇપી એસેસ શુદ્ધ અખંડ અથવા કાપેલા લેબલવાળા PACT નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યા હતા.કાઢવામાં આવેલ RNA RT-qPCR દ્વારા ચકાસવામાં આવ્યું હતું.i DARS-AS1, PACT અથવા બંનેને વધારે પડતા SW620 કોષોનો વૃદ્ધિ દર.j SW620 કોષોમાં પૂર્ણ-લંબાઈ અથવા કાપવામાં આવેલ DARS-AS1 ની વધુ પડતી અભિવ્યક્તિ કોષની વૃદ્ધિ પર વિવિધ અસરો ધરાવતી હતી.k એપોપ્ટોસિસ એન્ટી PARP એન્ટિબોડી સાથે ઇમ્યુનોબ્લોટિંગ દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું.l DARS-AS1 નો નોકઆઉટ ફ્લો સાયટોમેટ્રી દ્વારા દર્શાવ્યા પ્રમાણે SW620 કોષોના એપોપ્ટોસિસને પ્રેરિત કરે છે.દર્શાવેલ ડેટા એ ત્રણ પ્રયોગોનું સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન છે. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી ટેસ્ટ દ્વારા. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી ટેસ્ટ દ્વારા. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ દ્વારા. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001, 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001 બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ દ્વારા.
અમે પછી PACT એસોસિએશન (આકૃતિ 3e) માટે જરૂરી DARS-AS1 પ્રદેશને ઓળખવા માટે ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્શન દ્વારા ત્રણ બાયોટિનિલેટેડ DARS-AS1 RNA ટુકડાઓ જનરેટ કર્યા.RNA પૃથ્થકરણના પરિણામો દર્શાવે છે કે દરેક ટુકડો PACT સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરવામાં સક્ષમ હતો, પરંતુ 3′-ટર્મિનલ પ્રદેશ (384–768 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ A3 લેબલવાળા) એ 1-384 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ A1 લેબલ કરતાં વધુ દર્શાવે છે (ફિગ. 3e).રિકોમ્બિનન્ટ PACT (આકૃતિ 3f) નો ઉપયોગ કરીને ઇન વિટ્રો RIP એસેમાં સમાન પરિણામો જોવા મળ્યા હતા.આ પરિણામો સાથે સુસંગત, BLI નો ઉપયોગ કરીને PACT સાથે સ્થિર RNA ટુકડાઓ બાંધવાના પ્રયોગોએ એ પણ દર્શાવ્યું હતું કે PACT એ A3 (384–768 nt) (KD મૂલ્ય આશરે 94.6 nM) માટે ઉચ્ચ આકર્ષણ ધરાવે છે, જ્યારે અન્ય ક્ષેત્રો સાથે લગભગ કોઈ જોડાણ નથી.(ફિગ. 3d).
અમે PACT માં સંકળાયેલ બંધનકર્તા પ્રદેશોની પણ તપાસ કરી.PACT ત્રણ કાર્યાત્મક ડોમેન્સ ધરાવે છે, જેમાંથી બે ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ આરએનએ-બાઈન્ડિંગ ડોમેન્સ (dsRBD) અને ત્રીજું ડોમેન (નિયુક્ત D3) છે જે પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાના સક્રિયકર્તા તરીકે કાર્ય કરે છે.દરેક ડોમેનની lncRNA બંધનકર્તા ક્ષમતાની તપાસ કરવા માટે, અમે ત્રણ મ્યુટેશન એન્જીનિયર કર્યા છે જેણે ત્રણ ડોમેન્સમાંથી દરેકને દૂર કર્યા અને ઇન વિટ્રો RIP એસે કર્યું.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે PACT ના ત્રીજા ડોમેન (D3) ના કાઢી નાખવાથી અન્ય બે મ્યુટેશન (ફિગ. 3h) ની સરખામણીમાં DARS-AS1 (અખંડ PACT ની સરખામણીમાં 0.11-ગણો) સાથે તેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો છે, તે દર્શાવવામાં આવ્યું હતું કે પ્રકાશન D3 માંથી DARS સાથે વાતચીત કરી.-AC1.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 અને PACT વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા મુખ્યત્વે DARS-AS1 ના 3′ અંત અને PACT ના D3 ડોમેન દ્વારા થઈ શકે છે.
અમે નોંધ્યું છે કે DARS-AS1 ની PACT અભિવ્યક્તિ પર કોઈ અસર નથી અને PACT ની DARS-AS1 (પૂરક ફિગ. 3c) પર કોઈ અસર થઈ નથી.અમે પછી સેલ વૃદ્ધિ પર PACT નોકડાઉનની અસરની તપાસ કરી.DARS-AS1 થી વિપરીત, જ્યારે PACT ને પછાડવામાં આવ્યું ત્યારે સંબંધિત કોષો 1.5-3 ગણા ઝડપથી વધ્યા (પૂરક ફિગ. 3d).વસાહત રચના પરીક્ષાના પરિણામો દર્શાવે છે કે કોષો PACT (પૂરક ફિગ. 3e) સાથે shRNA સારવાર પછી 2-3-ગણી વસાહતો બનાવે છે.DARS-AS1 એ PACT દ્વારા કોષોના પ્રસારને નિયંત્રિત કરે છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે PACT, DARS-AS1 અથવા બંનેને વધારે પડતા SW620 કોષો જનરેટ કર્યા છે.PACT ના અતિશય અભિવ્યક્તિએ કોષના પ્રસારમાં નોંધપાત્ર અવરોધ દર્શાવ્યો (આકૃતિ 3i).જ્યારે DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેસન પ્રતિ se નોંધપાત્ર રીતે કોષોના પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે, ત્યારે DARS-AS1 અને PACT ને વધારે પડતા કોષોના વિકાસ દરમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો નથી.આ પરિણામો સૂચવે છે કે PACT DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેશનને કારણે થતા વધેલા પ્રસારનો પ્રતિકાર કરી શકે છે.
DARS-AS1 ના જુદા જુદા પ્રદેશોમાં વિવિધ PACT-બંધન ક્ષમતાઓ હોવાથી, અમે DARS-AS1 ટુકડાઓના અલગ-અલગ અતિશય અભિવ્યક્તિ દ્વારા સેલ પ્રસાર પર તેમના સંબંધિત પ્રભાવની તપાસ કરી.અન્ય બે ટુકડાઓની તુલનામાં, DARS-AS1 એ 3′ છેડે (384–768 nt), DARS-AS1 માં મુખ્ય PACT-સંબંધિત પ્રદેશ પર વધુ પડતું એક્સપ્રેસ થયું હતું, જેમાં કોષોના પ્રસારને ઉત્તેજીત કરવાની સૌથી વધુ ક્ષમતા હતી (ફિગ. 3j).આ પરિણામો DARS-AS1 ની બંધન ક્ષમતા અને જૈવિક કાર્ય વચ્ચે હકારાત્મક સહસંબંધ દર્શાવે છે.
PACT એ પ્રો-એપોપ્ટોટિક પ્રોટીન19 હોવાનું નોંધવામાં આવ્યું છે.તેથી, અમે એપોપ્ટોસિસ પર DARS-AS1 ની અસરની તપાસ કરી.અપેક્ષા મુજબ, DARS-AS1 નોકડાઉને SW620 કોષોમાં PARP ક્લીવેજમાં નોંધપાત્ર વધારો કર્યો અને SW620, HCT116, HepG2, અને MBA-MD-231 સેલ લાઇન (ફિગ. 3k) માં એનેક્સિન વી-પોઝિટિવ કોષોનું પ્રમાણ વધાર્યું.3).3f–h), સૂચવે છે કે કેન્સર કોષોમાં DARS-AS1 ની એન્ટિ-એપોપ્ટોટિક અસર PACT ના એપોપ્ટોસિસ-પ્રેરિત કાર્યની વિરુદ્ધ છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 ઓન્કોજેનિક કાર્યની પદ્ધતિ PACT કાર્યના અવરોધ દ્વારા હોઈ શકે છે.
આગળ, અમે DARS-AS1-PACT એસોસિએશનની કાર્યાત્મક અસરોની શોધ કરી.PACT ને પ્રત્યક્ષ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા PKR ને સક્રિય કરવાની જાણ કરવામાં આવી છે, જે પાછળથી eIF2α ફોસ્ફોરાયલેશનને વધારે છે, જે અનુવાદને કાઢી નાખવા અને એપોપ્ટોસિસ17નું કારણ બને છે.પ્રથમ, અમે તપાસ કરી કે શું DARS-AS1 PACT અને PKR ના સેલ્યુલર સ્થાનિકીકરણને અસર કરે છે.કોન્ફોકલ ફ્લોરોસેન્સ માઈક્રોસ્કોપી દર્શાવે છે કે PACT અને PKR SW620 કોષોમાં 0.72 ની સરેરાશ પીયર્સન સહસંબંધ ગુણાંક સાથે ખૂબ જ સ્થાનિક હતા.દરમિયાન, DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેસન નોંધપાત્ર રીતે PACT અને PKR સહ-સ્થાનિકીકરણ (મીન પીયર્સન સહસંબંધ ગુણાંક 0.61) (આકૃતિ 4a) ઘટાડે છે.DARS-AS1 PACT-PKR ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને મોડ્યુલેટ કરી શકે છે કે કેમ તેની તપાસ કરવા માટે, અમે SW620 સેલ લાઇસેટ્સમાં એન્ટિ-PACT એન્ટિબોડી સાથે કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (કો-આઇપી) એસે કર્યું.નિયંત્રણ કોશિકાઓમાં PKR વિરોધી PACT માં ખૂબ સમૃદ્ધ હતું, જ્યારે PKR પુનઃપ્રાપ્તિ DARS-AS1 (ફિગ. 4b) ને વધારે પડતા કોષોમાંથી lysates માં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો.શુદ્ધિકરણ લેબલવાળા PACT અને PKR નો ઉપયોગ ઇન વિટ્રો પ્રોટીન બાઈન્ડિંગ એસે માટે કરવામાં આવ્યો હતો.તદનુસાર, જેમણે DARS-AS1 પ્રદાન કર્યું હતું પરંતુ કોઈ નિયંત્રણ RNAએ દબાવી દીધું PACT-PKR ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દર્શાવ્યું હતું (આકૃતિ 4c).બધા પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 એ PACT અને PKR સંચારમાં વિક્ષેપ પાડ્યો હતો.
કન્ફોકલ ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને નિયંત્રણ કોષો અથવા DARS-AS1 ને વધારે પડતા કોષોમાં PACT અને PKR નું સહ-સ્થાનિકીકરણ જોવા મળ્યું હતું.ન્યુક્લિયસ DAPI થી ડાઘવાળા હતા.આંકડાકીય પરિણામો 16 ફોટોગ્રાફ્સમાંથી મેળવવામાં આવ્યા હતા.b કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (કો-આઇપી) નિયંત્રણ SW620 કોશિકાઓના સેલ લિસેટ્સમાં એન્ટી-PACT એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને અથવા DARS-AS1 ને વધારે પડતા કોષો.c લેબલ થયેલ PACT, શુદ્ધ PKR અને DARS-AS1 અથવા મોક RNA સાથે વિટ્રોમાં ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરેલ વિટ્રો પ્રોટીન બંધનકર્તા વિશ્લેષણ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન માટે એન્ટિ-ફ્લેગ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.d દર્શાવેલ એન્ટિબોડીઝ સાથેના ઇમ્યુનોબ્લોટ્સ SW620 અને HCT116 કોષોમાં નિયંત્રણ shRNA અથવા DARS-AS1-shRNA સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને ત્યારબાદ સીરમ ભૂખમરો થયો હતો.e DARS-AS1 અભિવ્યક્તિ સ્તરે થેપ્સીગાર્ગિન પ્રત્યે સેલ્યુલર સંવેદનશીલતામાં ફેરફાર કર્યો.SW620 કોષોને DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેસન પ્લાઝમિડ અથવા કંટ્રોલ પ્લાઝમિડ સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.કોષોને થેપ્સીગાર્ગિન સાથે 48 કલાક સુધી સારવાર આપવામાં આવી હતી અને MTS રીએજન્ટનો ઉપયોગ કરીને કોષની કાર્યક્ષમતા નક્કી કરવામાં આવી હતી.f ઇન વિટ્રો ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરેલ DARS-AS1 અથવા બનાવટી RNA અને શુદ્ધ PACT નો ઉપયોગ ઇન વિટ્રો એક્ટિવેશન એસે અને ઇમ્યુનોબ્લોટ શોધ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.g આ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોબ્લોટ્સ SW620-ctrl કોશિકાઓ (ડાબે) અથવા PKR મ્યુટન્ટ્સ (જમણે) ને વધારે પડતા કોષો પર કરવામાં આવ્યા હતા.આ કોષોને પછી નિયંત્રણ shRNA અથવા DARS-AS1-shRNA સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા અને ત્યારબાદ સીરમ ભૂખમરો થયો હતો.h ફ્લો સાયટોમેટ્રીએ દર્શાવ્યું હતું કે મ્યુટન્ટ PKR ની નિષ્ક્રિયતા SW620 કોષોમાં DARS-AS1-પ્રેરિત એપોપ્ટોસિસ માટે વળતર આપે છે.i સૂચવેલ એન્ટિબોડીઝ સાથે ઇમ્યુનોબ્લોટ્સ SW620 (ડાબે) અથવા HCT116 (જમણે) કોષોમાં કરવામાં આવ્યા હતા.કંટ્રોલ shRNA અથવા DARS-AS1 shRNA સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ થયેલા કોષો સીરમથી વંચિત છે અને 100 nM PKR C16 અવરોધક અથવા DMSO સાથે પૂરક છે.સ્કેલ બાર = 5 µm.દર્શાવેલ ડેટા એ ત્રણ પ્રયોગોનું સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન છે.* p ≤ 0.05 બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ.
સામાન્ય રીતે એવું માનવામાં આવે છે કે એકવાર PACT PKR17 સાથે સંપર્ક કરે છે, Thr451 પર PKR ફોસ્ફોરાયલેશન પ્રેરિત થઈ શકે છે.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે સીરમ ભૂખમરો (ફિગ. 4d અને પૂરક ફિગ. 4a) પછી DARS-AS1 નોકડાઉન કોષોમાં PKR ફોસ્ફોરાયલેશનનું સ્તર નોંધપાત્ર રીતે એલિવેટેડ હતું.તદનુસાર, અમે જોયું કે eIF2α, મુખ્ય PKR સબસ્ટ્રેટનું ફોસ્ફોરાયલેશન પણ DARS-AS1 shRNA (ફિગ. 4d અને પૂરક ફિગ. 4a) દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું હતું.થૅપ્સીગાર્ગિન એ ER સ્ટ્રેસર છે જે ERને Ca2+ છોડવાનું કારણ બને છે.થેપ્સીગાર્ગિન સાથેની સારવાર PACT ના અભિવ્યક્તિ અને સક્રિયકરણને પ્રેરિત કરવા માટે નોંધવામાં આવી છે, જે PKR સાથે વધુ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે અને સક્રિય કરે છે, જે eIF2α ફોસ્ફોરીલેશન 18,61 વધારીને એપોપ્ટોસિસ તરફ દોરી જાય છે.અહીં, અમે DARS-AS1 PACT/PKR પાથવેને અવરોધીને કોષોને તાણ દૂર કરવામાં મદદ કરી શકે છે કે કેમ તેની તપાસ કરવા PACT/PKR પાથવેના ઉત્તેજક તરીકે થેપ્સીગાર્ગિનનો ઉપયોગ કર્યો.અમે અવલોકન કર્યું છે કે DARS-AS1 અભિવ્યક્તિનું સ્તર થપસિગાર્ગિનના સેલ પ્રતિકાર સાથે હકારાત્મક રીતે સંકળાયેલું છે.SW620 કોષો જે DARS-AS1 ને વધારે અસર કરે છે તે થેપ્સીગાર્ગિન સાથે સારવાર કરવામાં આવે ત્યારે વધુ સારી રીતે બચી ગયા, જ્યારે DARS-AS1 નોકડાઉન સાથેના કોષો વધુ સંવેદનશીલ બન્યા (ફિગ. 4e).આ પરિણામો સાથે સુસંગત, DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેશન થૅપ્સીગાર્ગિન-પ્રેરિત PKR ફોસ્ફોરાયલેશન ઘટાડે છે (પૂરક ફિગ. 4b).તેનાથી વિપરીત, થેપ્સીગાર્ગિન સારવાર પછી, PKR અને eIF2α નિયંત્રણ કોષોની તુલનામાં DARS-AS1 નોકડાઉન કોશિકાઓમાં વધુ પ્રમાણમાં ફોસ્ફોરીલેટેડ હતા (પૂરક ફિગ. 4b).રસપ્રદ વાત એ છે કે, થેપ્સીગાર્ગિન ડોઝ-આશ્રિત રીતે DARS-AS1 અભિવ્યક્તિને પ્રેરિત કરે છે, જે DARS-AS1 (પૂરક ફિગ. 4c) ની તાણ-વિરોધી કાર્યને સૂચવી શકે છે.વધુમાં, અમે આ અવલોકનોની પુષ્ટિ કરવા માટે વિટ્રો એક્ટિવેશન એસેસ કર્યું.સંક્ષિપ્તમાં, PKR એ એન્ટિ-PKR એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કરીને સેલ લાઇસેટ્સમાંથી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું, પછી રિકોમ્બિનન્ટ PACT અને DARS-AS1 વિટ્રોમાં ટ્રાંસ્ક્રાઇબ કરવામાં આવ્યું હતું.એન્ઝાઇમેટિક પ્રતિક્રિયા પછી, ડબ્લ્યુબીનો ઉપયોગ કરીને ફોસ્ફો-પીકેઆર શોધી કાઢવામાં આવ્યું હતું.અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે PKR ફોસ્ફોરાયલેશન DARS-AS1 દ્વારા નોંધપાત્ર રીતે અટકાવવામાં આવ્યું હતું, પરંતુ નિયંત્રણ RNA (આકૃતિ 4f) દ્વારા નહીં.આ ઇન વિટ્રો અને ઇન વિવો પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 PACT- મધ્યસ્થી PKR સક્રિયકરણને અટકાવે છે.તે જ સમયે, અમે DARS-AS1 (આકૃતિ 4f) ની હાજરીમાં PACT પુનઃપ્રાપ્તિમાં ઘટાડો પણ જોયો છે.આ પરિણામ ઇન વિટ્રો પ્રોટીન બાઈન્ડિંગ એસે (આકૃતિ 4c) ના પરિણામો સાથે સુસંગત છે અને ફરીથી PACT-PKR એસોસિએશન માટે DARS-AS1 ના અવરોધિત કાર્યને સમજાવે છે.
PACT ના D3 ડોમેનમાં Ser246 અને Ser287 સેલ્યુલર તણાવ હેઠળ PKR સક્રિયકરણ માટે જરૂરી છે.એલનાઇન માટે બે સેરીન અવશેષોના અવેજીએ મ્યુટન્ટ PACT (mutD) આપ્યું, જેણે તણાવની ગેરહાજરીમાં PKR સક્રિય કર્યું, અને એલાનિન (mutA) ની અવેજીએ પ્રોટોકોલને ઉલટાવી દીધો.અમે DARS-AS1 સાથે સીધા જોડાણમાં આ ડોમેનનું મહત્વ દર્શાવ્યું હોવાથી, અમે DARS-AS1 સાથેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયામાં આ અવશેષો પણ સામેલ થઈ શકે છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે અમે આ બે PACT મ્યુટન્ટ્સ જનરેટ કર્યા છે.રસપ્રદ રીતે, બંને મ્યુટન્ટ્સે DARS-AS1 (પૂરક ફિગ. 4d) સાથે જોડવાની ક્ષમતા ગુમાવી દીધી હતી, જે સૂચવે છે કે DARS-AS1 સાથે કાર્યક્ષમ ક્રિયાપ્રતિક્રિયા માટે PACT પ્રોટીનની સંપૂર્ણ રચનાની જરૂર પડી શકે છે.
વધુમાં, અમારા પરિણામો એ પણ સૂચવે છે કે DARS-AS1-shRNA-પ્રેરિત સેલ પ્રસારના અવરોધને પ્રભાવશાળી નકારાત્મક PACT મ્યુટન્ટ (PACTmutA) અથવા પ્રભાવશાળી નકારાત્મક PKR મ્યુટન્ટ (PKRmut) (પૂરક ફિગ. 4e. e).પ્રભાવશાળી-નકારાત્મક PKR મ્યુટન્ટ્સની અતિશય અભિવ્યક્તિએ DARS-AS1 નોકડાઉન દ્વારા પ્રેરિત PKR ફોસ્ફોરાયલેશન તેમજ સીરમ-વંચિત કોષોમાં eIF2α ફોસ્ફોરાયલેશન (ફિગ. 4g) માં ઘટાડો કર્યો.વધુ મહત્ત્વની વાત એ છે કે, DARS-AS1 નોકડાઉન દ્વારા પ્રેરિત એપોપ્ટોટિક કોશિકાઓનું પ્રમાણ પણ PKRmut (ફિગ. 4h અને પૂરક ફિગ. 4g) ને વધારે પડતા કોષોમાં ઘટાડવામાં આવ્યું હતું.PKR કિનેઝ પ્રવૃત્તિનું નિષેધ પણ DARS-AS1 કાર્યને બગાડે છે, કારણ કે પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નોકડાઉન ભાગ્યે જ PKR અને eIF2α ફોસ્ફોરાયલેશનને ટ્રિગર કરે છે જ્યારે કોષોને PKR-વિશિષ્ટ C16 અવરોધક (ફિગ. 4i અને પૂરક ફિગ 4) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી.).એકસાથે લેવામાં આવે તો, અમારા પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 સેલ પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે, ઓછામાં ઓછા ભાગમાં, PACT- મધ્યસ્થી PKR સક્રિયકરણને અટકાવીને.
ટ્યુમોરીજેનેસિસમાં DARS-AS1 ની ભૂમિકાનું વધુ અન્વેષણ કરવા માટે, અમે માઉસ xenograft મોડલનો ઉપયોગ કરીને વિવો પ્રયોગો કર્યા. પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નો નોકડાઉન ઉંદરમાં ગાંઠની વૃદ્ધિમાં નાટકીય રીતે ઘટાડો કરે છે (p મૂલ્ય <0.0001) (ફિગ. 5a). પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નો નોકડાઉન ઉંદરમાં ગાંઠની વૃદ્ધિમાં નાટકીય રીતે ઘટાડો કરે છે (p મૂલ્ય <0.0001) (ફિગ. 5a). Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નોકડાઉન ઉંદરમાં ગાંઠની વૃદ્ધિમાં ભારે ઘટાડો કરે છે (p મૂલ્ય <0.0001) (આકૃતિ 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）.结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）. Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). પરિણામો દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નોકડાઉને ઉંદરમાં ગાંઠની વૃદ્ધિમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો છે (p મૂલ્ય <0.0001) (આકૃતિ 5a).આમ, DARS-AS1 નોકડાઉન જૂથમાં, સરેરાશ ગાંઠના જથ્થામાં લગભગ 72.9% અને સરેરાશ ગાંઠના જથ્થામાં લગભગ 87.8% (આકૃતિ 5b-d) નો નોંધપાત્ર ઘટાડો જોવા મળ્યો હતો.આ પરિણામો ભારપૂર્વક સૂચવે છે કે DARS-AS1 વિવોમાં ગાંઠની વૃદ્ધિને નોંધપાત્ર રીતે પ્રોત્સાહન આપી શકે છે.
નગ્ન ઉંદરમાં કોલોરેક્ટલ ઓન્કોજેનેસિસ પર જાહેરાત DARS-AS1 નોકડાઉનની અસરો.વૃદ્ધિ વળાંક (a), ગાંઠનું કદ (b), વજન (c), અને ગાંઠની છબીઓ (d) બતાવવામાં આવી છે.એરર બાર ±SEM દર્શાવે છે. n = 10. ****p < 0.0001, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી ટેસ્ટ દ્વારા. n = 10. ****p < 0.0001, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી ટેસ્ટ દ્વારા. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 ટુ-ટેલ્ડ વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ.n = 10. ****p < 0.0001, 通过双尾学生t 检验. ****p < 0.0001, 通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 ટુ-ટેલ્ડ વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ.e Kaplan-Meier એ DARS-AS1 અભિવ્યક્તિ સ્તરો અને UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM અને LGG ધરાવતા દર્દીઓમાં એકંદર અસ્તિત્વ વચ્ચેના સંબંધનું વિશ્લેષણ કર્યું.દર્દીઓમાં DARS-AS1 અભિવ્યક્તિનું ઉચ્ચ સ્તર ટોચના 50% માં હતું;દર્દીઓમાં DARS-AS1 અભિવ્યક્તિનું નીચું સ્તર 50% નીચે હતું.લોગ રેન્ક ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને p-મૂલ્યો નક્કી કરવામાં આવી હતી.f પ્રસ્તાવિત મોડેલ જેમાં DARS-AS1 PACT-PKR પાથવે અને ગાંઠની વૃદ્ધિને નિયંત્રિત કરે છે.
DARS-AS1 ની ક્લિનિકલ અસરને વધુ સારી રીતે સમજવા માટે, અમે તેની અભિવ્યક્તિ અને દર્દીના અસ્તિત્વ વચ્ચેના સંબંધની તપાસ કરી.TCGA ડેટાસેટનું વિશ્લેષણ કરીને, અમે જોયું કે ઉચ્ચ DARS-AS1 અભિવ્યક્તિ યુવેલ મેલાનોમા (UVM), રેનલ ક્રોમોફોબિયા (KICH), રેનલ પેપિલરી સેલ કાર્સિનોમા (KIRP), મેસોથેલિયોમા (MESO), મલ્ટીપ્લેક્સ સાથે સંકળાયેલી હતી.નિમ્ન અસ્તિત્વ નોંધપાત્ર રીતે ગ્લિઓબ્લાસ્ટોમા મોર્ફોસિસ (જીબીએમ) અને નિમ્ન-ગ્રેડ મગજ ગ્લિઓમા (એલજીજી) (આકૃતિ 5e) ધરાવતા દર્દીઓ સાથે સંકળાયેલું હતું.આ પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 ક્લિનિકલ ટ્યુમરની પ્રગતિમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવી શકે છે અને બહુવિધ કેન્સરમાં સંભવિત પૂર્વાનુમાન બાયોમાર્કર હોઈ શકે છે.
આ અભ્યાસમાં, મોટા પાયે CRISPRi ફંક્શનલ સ્ક્રિનિંગનો ઉપયોગ કરીને, અમે નિર્ધારિત કર્યું કે DARS-AS1 lncRNA એ બે મુખ્ય સ્ટ્રેસ રિસ્પોન્સર્સ, PACT અને PKRનું નિયમન કરીને કેન્સર સેલ તણાવને દૂર કરે છે.PACT સાથે સીધી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરીને, DARS-AS1 એ PACT- મધ્યસ્થી PKR સક્રિયકરણને અવરોધે છે, ત્યાંથી એપોપ્ટોટિક કોષ મૃત્યુને અટકાવે છે અને સેલ પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે (ફિગ. 5f).DARS-AS1 નું અપગ્ર્યુલેશન બહુવિધ પ્રકારના કેન્સરમાં જોવા મળ્યું છે, જે સૂચવે છે કે તણાવપૂર્ણ પરિસ્થિતિઓમાં કેન્સર સેલના અસ્તિત્વને પ્રોત્સાહન આપવાનું તેનું કાર્ય બહુવિધ પ્રકારના કેન્સરને વ્યાપકપણે લાગુ પડી શકે છે.
PACT ને PKR એક્ટિવેટર પ્રોટીન તરીકે ઓળખવામાં આવ્યું છે, અને PACT- મધ્યસ્થી PKR સક્રિયકરણ, ટ્રાન્સક્રિપ્શન, અનુવાદ, એપોપ્ટોસિસ અને અન્ય મહત્વપૂર્ણ સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓનું નિયમન કરીને તણાવ પ્રતિભાવોમાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે62.દાયકાઓથી, PACT-PKR કાસ્કેડના કેન્સર-વિશિષ્ટ નિયમનને સમજવાના પ્રયાસો કરવામાં આવ્યા છે.અહીં, અમારા અભ્યાસે સેલ્યુલર lncRNA DARS-AS1 દ્વારા કેન્સરના કોષોમાં PACT-PKR ના નિયમનની એક અલગ પદ્ધતિ જાહેર કરી છે, જે PACT સાથે સીધી રીતે જોડાય છે, PACT-PKR ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને અવરોધે છે, PKR સક્રિયકરણ અને eIF2α ફોસ્ફોરીલેશનને અટકાવે છે, જેનાથી તણાવ-પ્રેરિત એપોટોસિસને અટકાવે છે. કેન્સરના અંતિમ પ્રસારને ઉત્તેજિત કરે છે.કોષોઆ શોધ કેન્સર પૂર્વસૂચન અને ઉપચાર માટે સંભવિત lncRNA લક્ષ્યો પર પ્રકાશ પાડે છે.
અમારા ડેટા દર્શાવે છે કે DARS-AS1 નોકડાઉન ફોસ્ફોરીલેટેડ PKR અને eIF2α માં નોંધપાત્ર વધારો સાથે કોષોને સીરમ ભૂખમરો માટે સંવેદનશીલ બનાવે છે.આ પરિણામો સૂચવે છે કે DARS-AS1 PACT/PKR પ્રવૃત્તિને અટકાવીને કઠોર પરિસ્થિતિઓમાં કેન્સર સેલના અસ્તિત્વને પ્રોત્સાહન આપે છે.કેટલાક અન્ય નોન-કોડિંગ RNAs, જેમ કે ASPACT અને nc886, PACT48 mRNA ને ડાઉન રેગ્યુલેટ કરીને અથવા PKR49,50,64 સાથે બંધાઈને ઓટોફોસ્ફોરાયલેશનનું નિયમન કરીને PACT/PKR અક્ષમાં પણ સામેલ છે.તેમાંથી, DARS-AS1 PACT-PKR એસોસિએશનના વિક્ષેપકર્તા તરીકે કાર્ય કરે છે.આ અભ્યાસ PACT/PKR એક્સિસ રેગ્યુલેશન અને સ્ટ્રેસ રિસ્પોન્સમાં lncRNAs ની ભૂમિકા વિશેની અમારી સમજને સમૃદ્ધ બનાવે છે.
PACT ત્રણ અલગ ડોમેન્સ ધરાવે છે.પ્રથમ બે dsRBDsમાંથી દરેક PACT ને PKR સાથે ઉચ્ચ જોડાણ પ્રાપ્ત કરવા માટે પૂરતું છે, જ્યારે ત્રીજું ડોમેન (D3) વિટ્રો અને વિવોમાં PKR સક્રિયકરણ માટે જરૂરી છે.અમારા અભ્યાસ દર્શાવે છે કે DARS-AS1 પ્રાધાન્યતાપૂર્વક D3 ડોમેન (ફિગ. 3h) સાથે સંપર્ક કરે છે.lncRNA (768 ન્યુક્લિયોટાઇડ્સ) ના મોટા કદને જોતાં, DARS-AS1 D3 સાથે બંધનકર્તા dsRBD અને PKR ના PACT ડોમેન વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને શારીરિક રીતે અટકાવી શકે છે, ત્યાં PACT અને PKR ના જોડાણને અવરોધે છે.PACT પોઈન્ટ મ્યુટેશન કે જેણે Ser246 અને Ser287 ને D3 માં એલેનાઈન અથવા એસ્પાર્ટેટ સાથે બદલ્યું, તેના જોડાણમાં D3ના એકંદર માળખાકીય અને વિદ્યુત ગુણધર્મોના મહત્વ તરફ ઈશારો કરીને, DARS-AS1 માટે તેની બંધનકર્તા જોડાણને ખલેલ પહોંચાડી.ભવિષ્યમાં વધુ ચોક્કસ બાયોકેમિકલ વિશ્લેષણ અને ઉચ્ચ રિઝોલ્યુશન PACT માળખાકીય વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને આ પદ્ધતિની વધુ વિગતોની જરૂર પડશે.
અગાઉના અભ્યાસોએ અહેવાલ આપ્યો છે કે DARS-AS1 અનેક પદ્ધતિઓ દ્વારા સેલ પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે51,52,53.એક ઉદાહરણમાં, તપાસકર્તાઓએ અવલોકન કર્યું કે DARS-AS1 એ કિડનીના કેન્સર કોષોમાં miP-194-5p ને લક્ષ્ય બનાવીને તેના એન્ટિસેન્સ પ્રોટીન-એનકોડિંગ DARS જનીનને અપરેગ્યુલેટ કર્યું છે.જો કે, હાલના અભ્યાસમાં, DARS-AS1 નોકડાઉનની ઓછામાં ઓછા કોલોરેક્ટલ, સ્તન અને યકૃતના કેન્સર સહિત બહુવિધ પ્રકારના કેન્સરમાં DARS ટ્રાન્સક્રિપ્શન પર ઓછી અસર થઈ હતી.કારણ કે lncRNAs કોષ- અને પેશી-વિશિષ્ટ અભિવ્યક્તિ પેટર્ન પ્રદર્શિત કરે છે, કાર્યાત્મક પદ્ધતિઓ સમગ્ર કેન્સરના પ્રકારોમાં સાચવી શકાતી નથી, જે અમારા અવલોકનો અને વિવિધ કેન્સરના અગાઉના મૂલ્યાંકન વચ્ચેની આ વિસંગતતામાં ફાળો આપી શકે છે.વિવિધ શારીરિક અને રોગવિજ્ઞાનવિષયક પ્રક્રિયાઓની વિશિષ્ટ પદ્ધતિઓને સ્પષ્ટ કરવા માટે વિશેષ અભ્યાસની જરૂર છે.
ક્લિનિકલ ડેટાના વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ગાંઠોમાં DARS-AS1 અભિવ્યક્તિ કેન્સરના દર્દીઓના અસ્તિત્વ સાથે વિપરીત રીતે સંબંધિત છે, જે કેન્સર પૂર્વસૂચનમાં DARS-AS1/PACT/PKR ધરીના મહત્વને રેખાંકિત કરે છે.નિષ્કર્ષમાં, અમારો અભ્યાસ દર્શાવે છે કે DARS-AS1 એ PACT/PKR સિગ્નલિંગ અક્ષનું નિયમનકાર છે, કેન્સર કોષોના પ્રસારને પ્રોત્સાહન આપે છે, અને તણાવ પ્રતિભાવ દરમિયાન એપોપ્ટોસિસને અટકાવે છે, જે સંશોધનની બીજી લાઇન પૂરી પાડે છે અને સંભવિત સારવારમાં ભવિષ્યના સંશોધન માટે રસ ધરાવે છે. .
હ્યુમન સેલ લાઇન્સ SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 અને HEK293T ચીનમાં નેશનલ સેલ લાઇન રિસોર્સ ઇન્ફ્રાસ્ટ્રક્ચરમાંથી મેળવવામાં આવી હતી.તમામ કોષોને DMEM માધ્યમમાં જાળવવામાં આવ્યા હતા (DMEM, થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક, વોલ્થમ, MA) 10% FBS (જેમિની, બ્રુકલિન, NY) અને 1% પેનિસિલિન-સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક) સાથે 37°C, 5% CO2 પર પૂરક.ઇન્ક્યુબેટર
વિરોધી PACT, Abcam (ab31967);વિરોધી PKR, Abcam (ab184257);એન્ટિ-પીકેઆર (ફોસ્ફો-ટી451), એબકેમ (ab81303);એન્ટિ-ફ્લેગ, એબકેમ (ab125243);એન્ટિ-eIF2α, એબકેમ (A0764));anti-eIF2α (ફોસ્ફરસ S51), Abcam (ab32157);વિરોધી PACT (ફોસ્ફરસ S246), એબજન્ટ (AP7744b);એન્ટિ-બીટા-ટ્યુબ્યુલિન, CST (2128);સામાન્ય માઉસ IgG, CST (5415S);સામાન્ય સસલું IgG, CST (2729S).વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ માટે PBST માં એન્ટિબોડીઝ 1:1000 અને IP માટે 1:100 પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું.
sgRNAs CRISPR-ERA66 નામના સાર્વજનિક રીતે ઉપલબ્ધ સાધનનો ઉપયોગ કરીને વિકસાવવામાં આવ્યા હતા.અમે sgRNA ડેવલપમેન્ટ માટે ડિફૉલ્ટ ટૂલ પેરામીટર્સનો ઉપયોગ કર્યો છે અને 3 kb પ્રદેશમાં sgRNA બાઈન્ડિંગ સાઇટ્સની ગણતરી કરેલ અલ્ગોરિધમ.TSS પર કેન્દ્રિત.sgRNA ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સના પૂલને CustomArray, Inc. (બોથેવેલ, WA) ખાતે સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને માનવકૃત pgRNA પ્લાઝમિડ્સ (Addgene #44248) માં ક્લોન કરવામાં આવ્યું હતું.કુલ 12 µg પૂલ્ડ હ્યુમનાઈઝ્ડ pgRNA પ્લાઝમિડ, 7.2 µg psPAX2 (Addgene #12260), અને 4.8 µg pMD2.G (Addgene #12259) 5 x 106 HEK106 HEK293cm ડિસેક્શન ડિસફેક્ટમાં ટ્રાન્સફેક્ટનો ઉપયોગ કરીને સહ-ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. કોષો (CWBIO, બેઇજિંગ, ચીન) ઉત્પાદકની સૂચનાઓને અનુસરીને.વાઈરસ ધરાવતા સુપરનેટન્ટ્સ ટ્રાન્સફેક્શનના 48 અને 72 કલાક પછી એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા અને 0.45 µm ફિલ્ટર દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા.સ્ક્રીનીંગ માટે, dCas9/KRAB ફ્યુઝન પ્રોટીનને વ્યક્ત કરતા SW620 કોષો વાયરસ ટ્રાન્સડક્શન દ્વારા મેળવવામાં આવ્યા હતા.સંશોધિત SW620 કોષો 0.1-0.3 ના MOI પર ચાર સ્વતંત્ર ચેપ પ્રયોગોમાં વાયરસ લાઇબ્રેરીથી સંક્રમિત થયા હતા અને 2 દિવસ માટે 2 μg/ml પ્યુરોમાસીન (સિગ્મા, સેન્ટ લુઇસ, MO) સાથે નમૂના લેવામાં આવ્યા હતા.ત્યારબાદ, સ્ક્રીનીંગ માટે 500 કોષો/sgRNA ના ન્યૂનતમ લાઇબ્રેરી કવરેજ સાથે 18 દિવસ માટે વિટ્રોમાં કોષોનું સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું.
જીનોમિક ડીએનએ QIAamp DNA બ્લડ મિડી કિટ (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183) ની સૂચનાઓ અનુસાર કાઢવામાં આવ્યું હતું.કુલ મળીને, લાઇબ્રેરી બનાવવા માટે જૈવિક પુનરાવર્તન દીઠ 100 μg જીનોમિક ડીએનએનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.sgRNA પ્રદેશને PCR ના બે રાઉન્ડ દ્વારા વિસ્તૃત કરવામાં આવ્યો હતો અને તેને બારકોડ સાથે જોડવામાં આવ્યો હતો.
NucleoSpin® જેલ અને PCR શુદ્ધિકરણ કીટ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) નો ઉપયોગ કરીને PCR ઉત્પાદનોને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા અને Qubit™ HS ડબલ-સ્ટ્રેન્ડેડ DNA ડિટેક્શન કીટ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક; Q32854) નો ઉપયોગ કરીને પ્રમાણીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું.
કોષોના પ્રસારને માપવા માટે MTS એસેનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.કોષોને 2000 કોષ/કૂવાની પ્રારંભિક ઘનતા પર 96-વેલ પ્લેટમાં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા.કુલ 4-6 દિવસ માટે દર્શાવેલ સમયે દરરોજ કોષોની સંબંધિત સંખ્યા માપવામાં આવી હતી.દરેક કૂવા માટે, 20 μl MTS રીએજન્ટ (પ્રોમેગા) 100 μl DMEM સાથે પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું, 37°C પર 4 કલાક માટે કોષો સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું, અને પછી OD490 માપવામાં આવ્યું હતું.
ગોળાઓની રચનાનું વિશ્લેષણ કરીને અનએન્કર વગરની વૃદ્ધિની ક્ષમતા શોધી કાઢવામાં આવી હતી.સંક્ષિપ્તમાં, shRNA DARS-AS1 અથવા કંટ્રોલ shRNA સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ થયેલા 2000 કોષોને અલ્ટ્રા લો એટેચમેન્ટ માઇક્રોપ્લેટ્સ (કોર્નિંગ) માં દર 4 દિવસે મધ્યમ ફેરફાર સાથે સંવર્ધન કરવામાં આવ્યા હતા.ગોળાકારની ગણતરી 14 દિવસ પછી કરવામાં આવી હતી.DARS-AS1 ઓવરએક્સપ્રેસન પ્લાઝમિડ અથવા કંટ્રોલ પ્લાઝમિડ સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ થયેલા 500 કોષોનો ઉપયોગ ઉન્નતીકરણ પરીક્ષા માટે કરવામાં આવ્યો હતો, અન્યથા પદ્ધતિ યથાવત હતી.
Riboprobe® કોમ્બિનેશન સિસ્ટમ્સ (પ્રોમેગા P1440) ની સૂચનાઓ અનુસાર T7 RNA પોલિમરેઝ અને બાયોટિન-16-UTP (Roche 1138908910) નો ઉપયોગ કરીને RNA નું ટ્રાન્સક્રિપ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું.અહીં વપરાતા પ્રાઇમર્સ પૂરક કોષ્ટક 4 માં સૂચિબદ્ધ છે.
પ્રોટીન-કોડિંગ PACT અથવા PKR પ્રદેશોને pET15b (Addgene #73619) માં ક્લોન કરવામાં આવ્યા હતા અને BL21(DE3) માં પરિવર્તિત થયા હતા.બેક્ટેરિયાને એમ્પીસિલિન સાથે પૂરા પાડવામાં આવેલા એલબીમાં રાતોરાત ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને પછી તાજા એલબી સાથે 100-ગણા પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું.જ્યારે માધ્યમનું OD600 0.8 પર પહોંચ્યું, ત્યારે પ્રોટીન અભિવ્યક્તિને પ્રેરિત કરવા માટે 1 mM IPTG ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.હળવા ધ્રુજારી (20°C પર 250 rpm) સાથે રાતોરાત સેવન કર્યા પછી, સેલ પેલેટ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન (4000 rpm, 10 મિનિટ, 4°C) દ્વારા એકત્રિત કરવામાં આવી હતી.સેલ પેલેટને lysis બફર (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) માં પુનઃસસ્પેન્ડ કરો અને 30 મિનિટ માટે બરફ પર સેવન કરો, પછી સોનિકેટ (15 મિનિટ, 5 સે ચાલુ/બંધ, બરફ પર) અને સેન્ટ્રીફ્યુજ (130,000) આરપીએમ)., 30 મિનિટ, 4°С).સુપરનેટન્ટને પછી ની-એનટીએ રેઝિન (QIAGEN) પર 3 વખત 4°C પર લોડ કરવામાં આવ્યું હતું, વૉશ બફર (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM ઇમિડાઝોલ, 250 mM NaCl) વડે 4 વખત ધોવામાં આવ્યું હતું અને કુલ 3 વખત એલ્યુટ કરવામાં આવ્યું હતું. 10 મિલી એલ્યુએન્ટ બફર (50 એમએમ ટ્રિસ, પીએચ 8.0, 250 એમએમ NaCl, 300 એમએમ ઇમિડાઝોલ).શુદ્ધ પ્રોટીન WB નો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું અને Qubit™ પ્રોટીન એસે કીટ (થર્મો ફિશર સાયન્ટિફિક; Q 33212) નો ઉપયોગ કરીને એકાગ્રતા નક્કી કરવામાં આવી હતી.
RIP એસેસ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે ફેરફારો સાથે કરવામાં આવ્યા હતા.સંક્ષિપ્તમાં, 1x RIP બફર (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease10100000mM NaCl) (Roche, 1 mM DTT) અને 4 °C પર 15 મિનિટ માટે 13,000 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુજ.સુપરનેટન્ટને પછી પ્રોટીન A+G મેગ્નેટિક બીડ્સ (મિલિપોર) સાથે 5 μg એન્ટિ-PACT એન્ટિબોડી (એબીમ) અથવા IgG (CST) સાથે સંયોજિત કરવામાં આવ્યું હતું.મણકાને 5x RIP બફર વડે 5 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા, પછી પ્રોટીનનેઝ K (NEB) વડે પચવામાં આવ્યા હતા.આરએનએ ટ્રાઇઝોલ સાથે કાઢવામાં આવ્યું હતું અને RT-qPCR દ્વારા નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રાઇમર્સ પૂરક કોષ્ટક 5 માં રજૂ કરવામાં આવ્યા છે.
ઇન વિટ્રો RIP એસે સંશોધિત માનક RIP એસે પ્રોટોકોલ અનુસાર કરવામાં આવ્યું હતું.ઇન વિટ્રો ટ્રાન્સક્રિપ્ટેડ આરએનએના કુલ 5 pmol ને RIP બફર સાથે 1x પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને 5 મિનિટ માટે 65°C પર ઇન્ક્યુબેશન દ્વારા એનિલ કરવામાં આવ્યું હતું, ત્યારબાદ ઓરડાના તાપમાને ધીમી ઠંડક દ્વારા.કુલ 5 pmol અખંડ અથવા પરિવર્તિત ફ્લેગ-લેબલવાળા PACT પ્રોટીનને ઇ. કોલીમાંથી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 2 કલાક માટે પુનઃપ્રાપ્ત RNA સાથે સેવન કરો અને એન્ટિ-ફ્લેગ IP માટે RIP વિશ્લેષણ માટે ઉપરોક્ત પ્રક્રિયાને અનુસરો.
RNA એક્સ્ટેંશન પૃથ્થકરણ માટે, 1xRIP બફર સાથે 1×107 કોષો lysed કરવામાં આવ્યા હતા.4°C પર 15 મિનિટ માટે 13,000 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, સુપરનેટન્ટને 4°C પર 2 કલાક માટે 30 μl સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન મેગ્નેટિક બીડ્સ (બેકમેન) સાથે પ્રીટ્રીટેડ કરવામાં આવ્યું હતું.પછી શુદ્ધ કરેલ લાયસેટને યીસ્ટ tRNA સાથે સપ્લાય કરવામાં આવ્યું હતું અને 4°C પર રાતોરાત 40 pmol પુનઃપ્રાપ્ત RNA સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું, પછી બીજા 2 કલાક અને BSA સાથે અવરોધિત નવા સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન ચુંબકીય માળખાના 20 μl ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.વોશિંગ સ્ટેપમાં 5x RIP બફર સાથે 4 વખત અને 1x RIP બફર સાથે 4 વખતનો સમાવેશ થાય છે.સંબંધિત પ્રોટીનને બાયોટિન ઇલ્યુશન બફર (25 એમએમ ટ્રિસ-એચસીએલ, પીએચ 7.5, 12.5 એમએમ ડી-બાયોટિન, પીએમએસએફ) વડે અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને ન્યુપેજ 4-12% બિસ-ટ્રિસ જેલ (ઇનવિટ્રોજન) પર અલગ કરવામાં આવ્યા હતા.સિલ્વર સ્ટેનિંગ (બેયોટાઇમ બાયોટેકનોલોજી) પછી, એમએસ દ્વારા ચોક્કસ બેન્ડ એક્સાઇઝ કરવામાં આવ્યા હતા અને તેનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
PACT અને PKR વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને ચકાસવા માટે Co-IP વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.સંક્ષિપ્તમાં, 1 x RIP બફરમાં 1 x 107 lysed કોષોને 4°C પર 15 મિનિટ માટે 13,000 rpm પર સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા અનુસરીને સુપરનેટન્ટ લિસેટ્સ તૈયાર કરવામાં આવ્યા હતા.Lysates પ્રોટીન A + G ચુંબકીય માળખા સાથે લોડ કરવામાં આવ્યા હતા, 5 µg એન્ટિ-PACT એન્ટિબોડી સાથે સંયોજિત હતા, અને ધીમેધીમે 4°C પર રાતોરાત ફેરવવામાં આવ્યા હતા.મણકાને 5×RIP બફર વડે 3 વખત, 1×RIP બફર વડે બે વાર અને 1×SDS બફર વડે ધોવાઇ હતી.પુનઃપ્રાપ્ત પ્રોટીનનું SDS-PAGE જેલ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને WB દ્વારા શોધાયું હતું.
ફ્લેગ કરેલ PACT ના બે pmol અને PKR ના 1 pmol E. coli થી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.1× RIP બફરમાં પાતળું કરો અને 4 °C તાપમાને 2 કલાક માટે 10 pmol renatured RNA સાથે સેવન કરો.તે પછી, તેઓને વધારાના બે કલાક માટે પ્રોટીન A+G ચુંબકીય મણકો-કન્જુગેટેડ એન્ટિ-લેબલ એન્ટિબોડી સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.ત્યારબાદ મણકાને 1x RIP બફર વડે ચાર વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને 1x SDS બફર વડે એલ્યુટ કરવામાં આવ્યા હતા.પરિણામી PACT અને PKR WB દ્વારા શોધી કાઢવામાં આવ્યા હતા.