સમાચાર

Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ ધરાવે છે.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).આ દરમિયાન, સતત સમર્થન સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટને રેન્ડર કરીશું.
સક્રિય એસ્ટર્સ અથવા ફિનોક્સી રેડિકલ પર આધારિત એન્ઝાઇમેટિક પ્રોક્સિમિટી લેબલિંગ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ જીવંત કોષોમાં સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમ્સ અને પ્રોટીન ઇન્ટરેક્ટર્સને મેપ કરવા માટે વ્યાપકપણે થાય છે.જો કે, સક્રિય એસ્ટર્સ ઓછા પ્રતિક્રિયાશીલ હોય છે, જેના પરિણામે વિશાળ લેબલિંગ ત્રિજ્યામાં પરિણમે છે, અને પેરોક્સાઇડ સારવાર દ્વારા પેદા થતા ફિનોક્સી રેડિકલ રેડોક્સ પાથવેમાં દખલ કરી શકે છે.અહીં અમે મિનિએસઓજી ફોટોસેન્સિટાઇઝર પ્રોટીનને રસ ધરાવતા પ્રોટીન સાથે આનુવંશિક રીતે લિંક કરીને વિકસિત પ્રોક્સિમિટી લેબલિંગ ડિપેન્ડન્ટ ફોટોએક્ટિવેશન (PDPL) પદ્ધતિની જાણ કરીએ છીએ.વાદળી પ્રકાશ દ્વારા ઉત્તેજિત અને એક્સપોઝર સમય દ્વારા નિયંત્રિત, સિંગલટ ઓક્સિજન ઉત્પન્ન થાય છે અને પછી એનિલિન પ્રોબ દ્વારા હિસ્ટિડાઇન અવશેષોનું અવકાશી રીતે ઉકેલી લેબલિંગ પ્રાપ્ત થાય છે.અમે ઓર્ગેનેલ-વિશિષ્ટ પ્રોટીઓમ મેપિંગ દ્વારા તેની ઉચ્ચ વફાદારી દર્શાવીએ છીએ.ટર્બોઆઈડી સાથે PDPL ની બાજુ-બાજુની સરખામણી PDPL નું વધુ ચોક્કસ અને વ્યાપક પ્રોટીઓમિક કવરેજ દર્શાવે છે.આગળ, અમે રોગ-સંબંધિત ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ કોએક્ટિવેટર BRD4 અને E3 પાર્કિન લિગેસ પર PDPL લાગુ કર્યું અને અગાઉ અજાણ્યા ઇન્ટરેક્ટર્સ મળ્યાં.ઓવરએક્સપ્રેશન સ્ક્રીનીંગ દ્વારા, બે અજાણ્યા સબસ્ટ્રેટ, Ssu72 અને SNW1, પાર્કિન માટે ઓળખવામાં આવ્યા હતા, જેનું અધોગતિ સર્વવ્યાપકતા-પ્રોટીઝોમ પાથવે દ્વારા મધ્યસ્થી થાય છે.
પ્રોટીન નેટવર્કનું ચોક્કસ પાત્રાલેખન ઘણી મૂળભૂત સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓને અંતર્ગત કરે છે.તેથી, પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું અત્યંત સચોટ સ્પેટીઓટેમ્પોરલ મેપિંગ જૈવિક માર્ગો, રોગ પેથોલોજી અને ઉપચારાત્મક હેતુઓ માટે આ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓને વિક્ષેપિત કરવા માટે પરમાણુ આધાર પ્રદાન કરશે.આ માટે, જીવંત કોષો અથવા પેશીઓમાં ટેમ્પોરલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ શોધવા માટે સક્ષમ પદ્ધતિઓ અત્યંત ઇચ્છનીય છે.એફિનિટી પ્યુરિફિકેશન માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી (AP-MS) નો ઉપયોગ ઐતિહાસિક રીતે રસના પ્રોટીન (POIs) ના બંધનકર્તા ભાગીદારોને ઓળખવા માટે કરવામાં આવે છે.જથ્થાત્મક પ્રોટીઓમિક્સ પદ્ધતિઓના વિકાસ સાથે, બાયોપ્લેક્સ3.0 બનાવવામાં આવ્યું હતું, જે એપી-એમએસ પર આધારિત પ્રોટીન નેટવર્કનો સૌથી મોટો ડેટાબેઝ છે.એપી-એમએસ ખૂબ જ શક્તિશાળી હોવા છતાં, વર્કફ્લોમાં સેલ લિસિસ અને ડિલ્યુશન સ્ટેપ્સ નબળા અને ક્ષણિક બંધનકર્તા ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ તરફ પક્ષપાતી હોય છે અને લિસિસ પહેલાં કમ્પાર્ટમેન્ટલાઇઝેશનનો અભાવ હોય તેવા નકલી ક્રિયાપ્રતિક્રિયા જોડી જેવા પોસ્ટ-લિસિસ આર્ટિફેક્ટ્સ રજૂ કરે છે.
આ મુદ્દાઓને ઉકેલવા માટે, ક્રોસલિંકિંગ જૂથો સાથે અકુદરતી એમિનો એસિડ્સ (UAA) અને એન્ઝાઈમેટિક નજીકના લેબલિંગ (PL) પ્લેટફોર્મ્સ (દા.ત. APEX અને BioID)5 વિકસાવવામાં આવ્યા છે.જો કે UAA પદ્ધતિ સફળતાપૂર્વક ઘણી પરિસ્થિતિઓમાં લાગુ કરવામાં આવી છે અને ડાયરેક્ટ પ્રોટીન એડહેસિવ્સ પર માહિતી પ્રદાન કરે છે, UAA નિવેશ સાઇટનું ઑપ્ટિમાઇઝેશન હજુ પણ જરૂરી છે.વધુ મહત્ત્વની વાત એ છે કે, તે સ્ટોઇકિયોમેટ્રિક લેબલિંગ પદ્ધતિ છે જેમાં લેબલિંગ ઇવેન્ટ્સના ઉત્પ્રેરક રિવર્સલનો અભાવ છે.તેનાથી વિપરિત, બાયોઆઈડી પદ્ધતિ જેવી એન્ઝાઈમેટિક PL પદ્ધતિઓ, એન્જિનિયર્ડ બાયોટિન લિગેસને POI7 સાથે જોડે છે, જે પછીથી પ્રતિક્રિયાશીલ બાયોટીનીલ-એએમપી એસ્ટર મધ્યવર્તી બનાવવા માટે બાયોટિનને સક્રિય કરે છે.એન્ઝાઇમ આમ સક્રિય બાયોટિન "ક્લાઉડ" ને ઉત્પ્રેરિત કરે છે અને પ્રકાશિત કરે છે જે પ્રોક્સિમલ લાયસિન અવશેષોને લેબલ કરે છે.જો કે, BioID ને પર્યાપ્ત લેબલ સિગ્નલ મેળવવા માટે 12 કલાકથી વધુ સમયની જરૂર પડે છે, જે ટેમ્પોરલ રિઝોલ્યુશન સાથે તેનો ઉપયોગ અટકાવે છે.યીસ્ટ ડિસ્પ્લે પર આધારિત નિર્દેશિત ઉત્ક્રાંતિનો ઉપયોગ કરીને, ટર્બોઆઈડીને વધુ કાર્યક્ષમ બનવા માટે બાયોઆઈડી પર આધારિત ડિઝાઇન કરવામાં આવી હતી, જે 10 મિનિટની અંદર બાયોટિન સાથે કાર્યક્ષમ લેબલિંગને મંજૂરી આપે છે, વધુ ગતિશીલ પ્રક્રિયાઓનો અભ્યાસ કરવાની મંજૂરી આપે છે.કારણ કે ટર્બોઆઈડી અત્યંત સક્રિય છે અને અંતર્જાત બાયોટીન સ્તરો નિમ્ન-સ્તરના લેબલીંગ માટે પૂરતા છે, જ્યારે બાહ્ય લેબલીંગને એક્સોજેનસ બાયોટીનના ઉમેરા દ્વારા અત્યંત ઉન્નત અને સમયસર લેબલીંગની જરૂર પડે ત્યારે બેકગ્રાઉન્ડ લેબલીંગ સંભવિત સમસ્યા બની જાય છે.વધુમાં, સક્રિય એસ્ટર્સ નબળી રીતે પ્રતિક્રિયાશીલ હોય છે (t1/2 ~5 મિનિટ), જે મોટા લેબલિંગ ત્રિજ્યા તરફ દોરી શકે છે, ખાસ કરીને બાયોટિન 5 સાથે પડોશી પ્રોટીનની સંતૃપ્તિ પછી. અન્ય અભિગમમાં, એન્જિનિયર્ડ એસ્કોર્બેટ પેરોક્સિડેઝનું આનુવંશિક મિશ્રણ (એટલે ​​કે બાયોટિન- ફિનોલ રેડિકલ અને એક મિનિટ 9,10ની અંદર પ્રોટીન લેબલિંગને મંજૂરી આપે છે. APEX નો ઉપયોગ સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમ્સ, મેમ્બ્રેન પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ અને સાયટોસોલિક સિગ્નલિંગ પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ 11,12ને ઓળખવા માટે વ્યાપકપણે થાય છે. જો કે, પેરોક્સાઇડની ઊંચી સાંદ્રતાની જરૂરિયાત રેડોક્સ પ્રોટીન અથવા માર્ગને અસર કરી શકે છે, જે વિક્ષેપિત થઈ શકે છે. સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓ.
આમ, સેલ્યુલર પાથવેઝને નોંધપાત્ર રીતે ખલેલ પહોંચાડ્યા વિના ઉચ્ચ અવકાશી અને ટેમ્પોરલ ચોકસાઈ સાથે વધુ પ્રતિક્રિયાશીલ લેબલ-ત્રિજ્યા સપ્રેસન પ્રજાતિઓ પેદા કરવા સક્ષમ નવી પદ્ધતિ હાલની પદ્ધતિઓમાં એક મહત્વપૂર્ણ ઉમેરો હશે. પ્રતિક્રિયાશીલ પ્રજાતિઓમાં, સિંગલટ ઓક્સિજન તેના ટૂંકા જીવનકાળ અને મર્યાદિત પ્રસરણ ત્રિજ્યા (કોષોમાં t1/2 <0.6 µs)13ને કારણે અમારું ધ્યાન આકર્ષિત કરે છે. પ્રતિક્રિયાશીલ પ્રજાતિઓમાં, સિંગલટ ઓક્સિજન તેના ટૂંકા જીવનકાળ અને મર્યાદિત પ્રસરણ ત્રિજ્યા (કોષોમાં t1/2 <0.6 µs)13ને કારણે અમારું ધ્યાન આકર્ષિત કરે છે. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного ограниченного , ограниченного и ограниченного. સક્રિય સ્વરૂપોમાં, સિંગલટ ઓક્સિજન તેના ટૂંકા જીવનકાળ અને મર્યાદિત પ્રસરણ ત્રિજ્યા (કોષોમાં t1/2 <0.6 µs) 13ને કારણે અમારું ધ્યાન આકર્ષિત કરે છે.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中1/2 <0.6 µs）耬. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни , ограниченноги и ограниченноговкает/ સક્રિય સ્વરૂપોમાં, સિંગલટ ઓક્સિજન તેના ટૂંકા જીવનકાળ અને મર્યાદિત પ્રસરણ ત્રિજ્યા (કોષોમાં t1/2 <0.6 μs)ને કારણે આપણું ધ્યાન આકર્ષિત કરે છે.સિંગલ ઓક્સિજન મેથિઓનાઇન, ટાયરોસિન, હિસ્ટીડિન અને ટ્રિપ્ટોફનનું અવ્યવસ્થિત રીતે ઓક્સિડાઇઝ કરવા માટે નોંધવામાં આવ્યું છે, જે તેને એમાઇન અથવા થિયોલ આધારિત પ્રોબ્સ16,17 સાથે જોડાણ માટે ધ્રુવીય 14,15 બનાવે છે.સબસેલ્યુલર કમ્પાર્ટમેન્ટ આરએનએને લેબલ કરવા માટે સિંગલ ઓક્સિજનનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હોવા છતાં, અંતર્જાત POI નિકટતા માર્કર્સને પુનઃઉપયોગ કરવાની વ્યૂહરચનાઓ અન્વેષિત રહી છે.અહીં, અમે ફોટોએક્ટિવેશન-ડિપેન્ડન્ટ પ્રોક્સિમિટી લેબલિંગ (PDPL) નામનું પ્લેટફોર્મ રજૂ કરીએ છીએ, જ્યાં અમે મિનિએસઓજી ફોટોસેન્સિટાઇઝર સાથે ફ્યુઝ્ડ POI ને પ્રકાશિત કરવા માટે વાદળી પ્રકાશનો ઉપયોગ કરીએ છીએ અને સમીપસ્થ અવશેષોને ઓક્સિડાઇઝ કરવા માટે સિંગલટ ઓક્સિજન જનરેશનને ટ્રિગર કરીએ છીએ, ત્યારપછી રાસાયણિક તપાસમાં ઓક્સિડાઇઝ કરવા માટે એમાઇન-સમાવતી ફેરફારો દ્વારા. મધ્યવર્તી જીવંત કોષો..અમે ટેગ વિશિષ્ટતા વધારવા અને ઓપન પ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લોનો ઉપયોગ કરીને ફેરફારની સાઇટ્સ ઓળખી કાઢવા માટે રાસાયણિક ચકાસણીઓના જૂથનું પરીક્ષણ કર્યું.ટર્બોઆઈડી સાથે PDPL ની બાજુ-બાજુની સરખામણી PDPL નું વધુ ચોક્કસ અને વ્યાપક પ્રોટીઓમિક કવરેજ દર્શાવે છે.અમે સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમના ઓર્ગેનેલ-વિશિષ્ટ માર્કર્સ અને કેન્સર-સંબંધિત એપિજેનેટિક રેગ્યુલેટરી પ્રોટીન BRD4 અને પાર્કિન્સન રોગ-સંબંધિત E3 લિગેસ પાર્કિન માટે બંધનકર્તા ભાગીદારોની સામાન્ય પ્રોટીઓમ ઓળખ માટે આ અભિગમ લાગુ કર્યો, જેણે પ્રોટીનના જાણીતા અને અજાણ્યા નેટવર્કની પુષ્ટિ કરી. ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ.મોટા પ્રોટીન સંકુલમાં E3 સબસ્ટ્રેટ્સને ઓળખવાની PDPL ની ક્ષમતા એવી પરિસ્થિતિનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે જ્યાં પરોક્ષ બાઈન્ડરની ઓળખ જરૂરી છે.સર્વવ્યાપકતા-પ્રોટીઝોમ દ્વારા મધ્યસ્થી કરાયેલા બે અજાણ્યા પાર્કિન સબસ્ટ્રેટની સ્થિતિમાં પુષ્ટિ કરવામાં આવી છે.
ફોટોડાયનેમિક થેરાપી (PDT)19 અને ક્રોમોફોર-આસિસ્ટેડ લેસર નિષ્ક્રિયકરણ (CALI)20, જેમાં ફોટોસેન્સિટાઇઝર્સ સાથે પ્રકાશ ઇરેડિયેશન સિંગલ ઓક્સિજન ઉત્પન્ન કરે છે, લક્ષ્ય પ્રોટીનને નિષ્ક્રિય કરી શકે છે અથવા કોષ મૃત્યુનું કારણ બની શકે છે.સિંગલટ ઓક્સિજન લગભગ 70 એનએમના સૈદ્ધાંતિક પ્રસરણ અંતર સાથે અત્યંત પ્રતિક્રિયાશીલ પદાર્થ હોવાથી, ફોટોસેન્સિટાઇઝરની આસપાસ અવકાશી રીતે મર્યાદિત ઓક્સિડેશનને નિયંત્રિત કરી શકાય છે.આ ખ્યાલના આધારે, અમે જીવંત કોષોમાં પ્રોટીન સંકુલના નજીકના લેબલિંગને પ્રાપ્ત કરવા માટે સિંગલ ઓક્સિજનનો ઉપયોગ કરવાનું નક્કી કર્યું.અમે ચાર કાર્યોને પરિપૂર્ણ કરવા માટે PDPL કેમોપ્રોટીઓમિક અભિગમ વિકસાવ્યો છે: (1) PL એન્ઝાઈમેટિક અભિગમની જેમ સક્રિય સિંગલટ ઓક્સિજનના ઉત્પાદનને ઉત્પ્રેરિત કરવા;(2) પ્રકાશ દીક્ષા પર સમય-ઉકેલ લેબલિંગ પ્રદાન કરો;(3) ફેરફાર દ્વારા (4) પૃષ્ઠભૂમિ ઘટાડવા માટે અંતર્જાત કોફેક્ટર્સ (જેમ કે બાયોટિન) નો ઉપયોગ કરવાનું ટાળો, અથવા પર્યાવરણીય તાણના સેલ એક્સપોઝરને ઘટાડવા માટે અત્યંત અવ્યવસ્થિત એક્ઝોજેનસ રીએજન્ટ્સ (જેમ કે પેરોક્સાઇડ્સ) નો ઉપયોગ કરો.
ફોટોસેન્સિટાઇઝર્સને બે કેટેગરીમાં વિભાજિત કરી શકાય છે જેમાં નાના પરમાણુ વજનવાળા ફ્લોરોફોર્સ (દા.ત. રોઝ બેંગલ, મેથીલીન બ્લુ)22 અને આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ નાના પ્રોટીન (દા.ત. મિનીએસઓજી, કિલર રેડ) 23નો સમાવેશ થાય છે.મોડ્યુલર ડિઝાઇન હાંસલ કરવા માટે, અમે POI24,25 (આકૃતિ 1a) માં ફોટોસેન્સિટાઇઝર (PS) પ્રોટીન ઉમેરીને પ્રથમ પેઢીનું PDPL પ્લેટફોર્મ વિકસાવ્યું છે.જ્યારે વાદળી પ્રકાશથી ઇરેડિયેટ થાય છે, ત્યારે સિંગલટ ઓક્સિજન પ્રોક્સિમલ ન્યુક્લિયોફિલિક એમિનો એસિડ અવશેષોને ઓક્સિડાઇઝ કરે છે, પરિણામે અમ્પોલંગ ધ્રુવીયતા જે ઇલેક્ટ્રોફિલિક હોય છે અને એમાઇન પ્રોબ ન્યુક્લિયોફાઇલ્સ 16,17 સાથે વધુ પ્રતિક્રિયા કરી શકે છે.ચકાસણીને ક્લિક રસાયણશાસ્ત્રની મંજૂરી આપવા અને એલસી/એમએસ/એમએસ પાત્રાલેખન માટે નીચે ખેંચવા માટે એલ્કાઇન હેન્ડલ સાથે ડિઝાઇન કરવામાં આવી છે.
મિનિએસઓજી દ્વારા મધ્યસ્થી પ્રોટીન સંકુલના લેબલિંગનું યોજનાકીય ચિત્ર.જ્યારે વાદળી પ્રકાશના સંપર્કમાં આવે છે, ત્યારે miniSOG-POI વ્યક્ત કરતા કોષો સિંગલ ઓક્સિજન ઉત્પન્ન કરે છે, જે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા પ્રોટીનને સુધારે છે પરંતુ બિન-બંધનકર્તા પ્રોટીનને નહીં.ફોટોઓક્સિડેશનના મધ્યવર્તી ઉત્પાદનોને સહસંયોજક એડક્ટ્સ બનાવવા માટે એમાઈન કેમિકલ પ્રોબના રિલે લેબલ્સ દ્વારા અટકાવવામાં આવે છે.રસાયણશાસ્ત્રની તપાસ પરનું એલ્કીનિલ જૂથ પુલ-ડાઉન અને LC-MS/MS ક્વોન્ટિટેશન દ્વારા સંવર્ધન માટે ક્લિક રસાયણશાસ્ત્રને મંજૂરી આપે છે.b એમાઈન પ્રોબ્સનું રાસાયણિક માળખું 1-4.c પ્રોબ્સ 1-4નો ઉપયોગ કરીને મિટોકોન્ડ્રીયલ સ્થાનિક મિનિએસઓજી-મધ્યસ્થી પ્રોટીઓમિક માર્કર્સનું પ્રતિનિધિ ફ્લોરોસન્ટ જેલ વિશ્લેષણ અને જેલ ડેન્સિટોમેટ્રીના આધારે સંબંધિત પ્રમાણીકરણ.વાદળી પ્રકાશને બાદ કરતા નકારાત્મક નિયંત્રણ પ્રયોગોનો ઉપયોગ કરીને અથવા મિનિએસઓજી અભિવ્યક્તિ વિના HEK293T કોષોનો ઉપયોગ કરીને રાસાયણિક ચકાસણીઓના સિગ્નલ-ટુ-બેકગ્રાઉન્ડ રેશિયોનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.n = 2 જૈવિક રીતે સ્વતંત્ર નમૂનાઓ.દરેક બિંદુ જૈવિક પ્રતિકૃતિ દર્શાવે છે.d દર્શાવેલ PDPL ઘટકોની હાજરી અથવા ગેરહાજરીમાં ઑપ્ટિમાઇઝ પ્રોબ 3 નો ઉપયોગ કરીને PDPL ની પ્રતિનિધિ શોધ અને પ્રમાણીકરણ.n = 3 જૈવિક રીતે સ્વતંત્ર નમૂનાઓ.દરેક બિંદુ જૈવિક પ્રતિકૃતિ દર્શાવે છે.મધ્ય રેખાઓ અને મૂછો સરેરાશ અને ± પ્રમાણભૂત વિચલનનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.CBB: Coomassie બ્રિલિયન્ટ બ્લુ.e દૂર-લાલ Si-DMA ડાઘ સાથે સિંગલ ઓક્સિજનની કોન્ફોકલ ઇમેજિંગ.સ્કેલ બાર: 10 µm.જેલ ઇમેજિંગ અને કોન્ફોકલ પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે ઓછામાં ઓછા બે વાર સ્વતંત્ર રીતે પુનરાવર્તિત થયા હતા.
અમે પ્રથમ પરિપક્વ ફોટોસેન્સિટાઇઝર્સ miniSOG26 અને KillerRed23 ની ક્ષમતાનું પરીક્ષણ કર્યું, જે HEK293T માં સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરવામાં આવ્યું હતું, રાસાયણિક તપાસ (પૂરક ફિગ. 1a) તરીકે પ્રોટીઓમના પ્રોપાર્ગીલામાઇન લેબલિંગને મધ્યસ્થી કરવા માટે.જેલ ફ્લોરોસેન્સ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે મિનિએસઓજી અને વાદળી પ્રકાશ ઇરેડિયેશનનો ઉપયોગ કરીને સંપૂર્ણ પ્રોટીઓમ લેબલિંગ પ્રાપ્ત થયું હતું, જ્યારે કિલરરેડ સાથે કોઈ દૃશ્યમાન લેબલિંગ ઉત્પાદન જોવા મળ્યું ન હતું.સિગ્નલ-ટુ-બેકગ્રાઉન્ડ રેશિયોને સુધારવા માટે, અમે પછી એનિલિન (1 અને 3), પ્રોપિલેમાઇન (2), અથવા બેન્ઝીલેમાઇન (4) ધરાવતા રાસાયણિક ચકાસણીઓના સમૂહનું પરીક્ષણ કર્યું.અમે અવલોકન કર્યું છે કે HEK293T કોષોમાં વાદળી પ્રકાશની તુલનામાં ઉચ્ચ પૃષ્ઠભૂમિ સિગ્નલ છે, સંભવતઃ એન્ડોજેનસ રિબોફ્લેવિન ફોટોસેન્સિટાઇઝર, ફ્લેવિન મોનોન્યુક્લિયોટાઇડ (FMN) 27 ને કારણે. એનિલાઇન-આધારિત રાસાયણિક ચકાસણીઓ 1 અને 3 એ વધુ સારી વિશિષ્ટતા આપી છે, જેમાં HEK293T સ્થિરપણે મિટોકોન્ડ્રિયામાં મિનિએસઓજી દર્શાવે છે જે ચકાસણી 3 માટે સિગ્નલમાં 8-ગણો વધારો દર્શાવે છે, જ્યારે RNA-લેબલિંગ પદ્ધતિ CAP-seqમાં વપરાતી ચકાસણી 2 માત્ર ~2.5- દર્શાવે છે. ફોલ્ડ સિગ્નલમાં વધારો, RNA અને પ્રોટીન (ફિગ. 1b, c) વચ્ચે અલગ-અલગ પ્રતિક્રિયાશીલતા પસંદગીઓને કારણે. એનિલાઇન-આધારિત રાસાયણિક ચકાસણીઓ 1 અને 3 એ વધુ સારી વિશિષ્ટતા આપી છે, જેમાં HEK293T સ્થિરપણે મિટોકોન્ડ્રિયામાં મિનિએસઓજી દર્શાવે છે જે ચકાસણી 3 માટે સિગ્નલમાં 8-ગણો વધારો દર્શાવે છે, જ્યારે RNA-લેબલિંગ પદ્ધતિ CAP-seqમાં વપરાતી ચકાસણી 2 માત્ર ~2.5- દર્શાવે છે. ફોલ્ડ સિગ્નલમાં વધારો, RNA અને પ્રોટીન (ફિગ. 1b, c) વચ્ચે અલગ-અલગ પ્રતિક્રિયાશીલતા પસંદગીઓને કારણે.એનિલાઇન-આધારિત રાસાયણિક ચકાસણીઓ 1 અને 3 એ વધુ સારી વિશિષ્ટતા દર્શાવી: HEK293T, જે મિટોકોન્ડ્રિયામાં મિનિએસઓજીને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરે છે, તે ચકાસણી 3 માટે સંકેતમાં 8-ગણો વધારો દર્શાવે છે, જ્યારે ચકાસણી 2, CAP-seq RNA લેબલિંગ પદ્ધતિમાં વપરાય છે, માત્ર ~2.5-ગણો સિગ્નલ વધારો દર્શાવે છે, કદાચ RNA અને પ્રોટીન (ફિગ. 1b, c) વચ્ચે વિવિધ પ્રતિક્રિયાશીલતા પસંદગીઓને કારણે.; 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b,c）.; - 倍信号增加,可能是由于RNAએનિલાઇન-આધારિત રાસાયણિક ચકાસણી 1 અને 3 વધુ સારી વિશિષ્ટતા ધરાવે છે, HEK293T એ મિટોકોન્ડ્રિયામાં સ્થિરપણે miniSOG વ્યક્ત કર્યું હતું, અને ચકાસણી 3 એ સંકેતમાં 8-ગણો વધારો કર્યો હતો, જ્યારે CAP-seq RNA લેબલિંગ પદ્ધતિ માટે ચકાસણી 2 માત્ર ~2.5-ગણો વધારો દર્શાવે છે.સિગ્નલમાં, કદાચ RNA અને પ્રોટીન (ફિગ. 1b, c) વચ્ચેની વિવિધ પ્રતિક્રિયા પસંદગીઓને કારણે.વધુમાં, ચકાસણી 3 આઇસોમર્સ અને હાઇડ્રેજિન પ્રોબ્સ (પ્રોબ્સ 5, 6, 7) નું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું, જે ચકાસણી 3 (પૂરક ફિગ. 1b,c) ના ઑપ્ટિમાઇઝેશનની પુષ્ટિ કરે છે.એ જ રીતે, ઇન-જેલ ફ્લોરોસેન્સ વિશ્લેષણ અન્ય ઑપ્ટિમાઇઝ પ્રાયોગિક પરિમાણો જાહેર કરે છે: ઇરેડિયેશન તરંગલંબાઇ (460 એનએમ), રાસાયણિક ચકાસણી સાંદ્રતા (1 એમએમ), અને ઇરેડિયેશન સમય (20 મિનિટ) (પૂરક ફિગ. 2a–c).PDPL પ્રોટોકોલમાં કોઈપણ ઘટક અથવા પગલાને અવગણવાથી પૃષ્ઠભૂમિમાં નોંધપાત્ર સિગ્નલ રિવર્સલ થાય છે (ફિગ. 1d).નોંધપાત્ર રીતે, સોડિયમ એઝાઇડ અથવા ટ્રોલોક્સની હાજરીમાં પ્રોટીન લેબલિંગમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો, જે સિંગલ ઓક્સિજનને શાંત કરવા માટે જાણીતા છે.D2O ની હાજરી, જે સિંગલ ઓક્સિજનને સ્થિર કરવા માટે જાણીતી છે, તે લેબલિંગ સિગ્નલને વધારે છે.લેબલિંગમાં અન્ય પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓના યોગદાનની તપાસ કરવા માટે, અનુક્રમે 18, 29, હાઇડ્રોક્સિલ અને સુપરઓક્સાઇડ રેડિકલ સ્કેવેન્જર્સની સ્થાપના કરવા માટે મન્નિટોલ અને વિટામિન સી ઉમેરવામાં આવ્યા હતા, પરંતુ તેઓ લેબલિંગ ઘટાડવામાં આવ્યા ન હતા.H2O2 ના ઉમેરણ, પરંતુ રોશની નહીં, લેબલિંગમાં પરિણમ્યું નથી (પૂરક ફિગ. 3a).Si-DMA પ્રોબ્સ સાથે ફ્લોરોસેન્સ સિંગલ ઓક્સિજન ઇમેજિંગે HEK293T-miniSOG વાયરમાં સિંગલ ઓક્સિજનની હાજરીની પુષ્ટિ કરી, પરંતુ મૂળ HEK293T વાયરમાં નહીં.વધુમાં, mitoSOX Red પ્રકાશ પછી સુપરઓક્સાઇડનું ઉત્પાદન શોધી શક્યું નથી (ફિગ. 1e અને પૂરક ફિગ. 3b) 30. આ ડેટા ભારપૂર્વક સૂચવે છે કે સિંગલ ઓક્સિજન એ અનુગામી પ્રોટીઓમિક લેબલિંગ માટે જવાબદાર મુખ્ય પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિ છે.પીડીપીએલની સાયટોટોક્સિસિટીનું મૂલ્યાંકન વાદળી પ્રકાશ ઇરેડિયેશન અને રાસાયણિક ચકાસણીઓ સહિત કરવામાં આવ્યું હતું, અને કોઈ નોંધપાત્ર સાયટોટોક્સિસિટી જોવા મળી ન હતી (પૂરક ફિગ. 4a).
લેબલીંગ મિકેનિઝમનો અભ્યાસ કરવા અને એલસી-એમએસ/એમએસનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સની પ્રોટીઓમિક ઓળખને સક્ષમ કરવા માટે, આપણે સૌ પ્રથમ એ નક્કી કરવાની જરૂર છે કે કયા એમિનો એસિડમાં ફેરફાર કરવામાં આવ્યો છે અને પ્રોબ લેબલનો ડેલ્ટા માસ.સિંગલ ઓક્સિજન 14,15 દ્વારા મેથિઓનાઇન, હિસ્ટિડિન, ટ્રિપ્ટોફન અને ટાયરોસિન સંશોધિત થયા હોવાનું નોંધાયું છે.અમે TOP-ABPP31 વર્કફ્લોને MSFragger32 પર આધારિત FragPipe કમ્પ્યુટિંગ પ્લેટફોર્મ દ્વારા પૂરી પાડવામાં આવેલ નિષ્પક્ષ ઓપન સર્ચ સાથે એકીકૃત કરીએ છીએ.સિંગલટ ઓક્સિજન મોડિફિકેશન અને કેમિકલ પ્રોબ લેબલિંગ પછી, ક્લીવેબલ લિંકર ધરાવતા બાયોટિન રિડક્શન લેબલનો ઉપયોગ કરીને ક્લિક કેમિસ્ટ્રી કરવામાં આવી હતી, ત્યારબાદ ન્યુટ્રાવિડિન સ્ટ્રેચિંગ અને ટ્રિપ્સિન પાચન કરવામાં આવ્યું હતું.સંશોધિત પેપ્ટાઈડ, હજુ પણ રેઝિન સાથે બંધાયેલ છે, એલસી-એમએસ/એમએસ વિશ્લેષણ (આકૃતિ 2a અને પૂરક ડેટા 1) માટે ફોટોક્લીવ કરવામાં આવ્યું હતું.50 થી વધુ પેપ્ટાઈડ મેપ (PSM) મેચો સૂચિબદ્ધ (ફિગ. 2b) સાથે સમગ્ર પ્રોટીઓમમાં મોટી સંખ્યામાં ફેરફારો થયા છે.આશ્ચર્યજનક રીતે, અમે માત્ર હિસ્ટિડાઇનમાં ફેરફાર જોયો છે, કદાચ અન્ય એમિનો એસિડ્સ કરતાં એનિલિન પ્રોબ્સ તરફ ઓક્સિડાઇઝ્ડ હિસ્ટિડાઇનની ઉચ્ચ પ્રતિક્રિયાને કારણે.સિંગલટ ઓક્સિજન દ્વારા હિસ્ટીડિન ઓક્સિડેશનની પ્રકાશિત પદ્ધતિ અનુસાર, +229 Da નું સૂચિત ડેલ્ટા-માસ માળખું બે ઓક્સિડેશન પછી 2-ઓક્સો-હિસ્ટીડાઇન સાથે પ્રોબ 3ના એડક્ટને અનુરૂપ છે, જ્યારે +247 Da એ હાઇડ્રોલિસિસ પ્રોડક્ટ છે. +229 Da (પૂરક ફિગ. 5).MS2 સ્પેક્ટ્રમના મૂલ્યાંકનમાં સંશોધિત ફ્રેગમેન્ટ આયનો (y અને b) (ફિગ. 2c) ની ઓળખ સહિત મોટાભાગના y અને b આયનોની ઓળખની ઉચ્ચ વિશ્વસનીયતા દર્શાવવામાં આવી છે.PDPL-સંશોધિત હિસ્ટિડાઇન્સના સ્થાનિક ક્રમના સંદર્ભ વિશ્લેષણમાં ±1 સ્થાનો પર નાના હાઇડ્રોફોબિક અવશેષો માટે મધ્યમ હેતુની પસંદગી જાહેર કરવામાં આવી છે (પૂરક ફિગ. 4b).સરેરાશ, પ્રોટીન દીઠ 1.4 હિસ્ટિડાઇન્સની ઓળખ કરવામાં આવી હતી, અને આ માર્કર્સની સાઇટ્સ દ્રાવક સુલભ સપાટી વિસ્તાર (SASA) અને સંબંધિત દ્રાવક ઉપલબ્ધતા (RSA) વિશ્લેષણ (પૂરક ફિગ. 4c,d) દ્વારા નક્કી કરવામાં આવી હતી.
MSFragger દ્વારા સંચાલિત FragPipe કમ્પ્યુટિંગ પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કરીને શેષ પસંદગીના અભ્યાસ માટે એક નિષ્પક્ષ કાર્યપ્રવાહ.સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન રેઝિનમાંથી સંશોધિત પેપ્ટાઈડ્સના ફોટોક્લેવેજને મંજૂરી આપવા માટે ક્લીવેબલ લિંકર્સનો ઉપયોગ ક્લિક રસાયણશાસ્ત્રમાં થાય છે.અસંખ્ય ફેરફારો, તેમજ સંબંધિત અવશેષોને ઓળખવા માટે ખુલ્લી શોધ શરૂ કરવામાં આવી હતી.b સમગ્ર પ્રોટીઓમમાં થતા ફેરફારોના સમૂહને સોંપો.પેપ્ટાઇડ મેપિંગ PSM.c MS2 તપાસ 3 સાથે સંશોધિત હિસ્ટિડિન સાઇટ્સની સ્પેક્ટ્રલ એનોટેશન. પ્રતિનિધિ ઉદાહરણ તરીકે, પ્રોબ 3 સાથેની સહસંયોજક પ્રતિક્રિયાએ સંશોધિત એમિનો એસિડમાં +229.0938 Da ઉમેર્યું.d PDPL માર્કર્સ માટે ચકાસવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતી મ્યુટેશન એસે.PRDX3 (H155A, H225A) અને PRDX1 (H10A, H81A, H169A) ને એન્ટિ-ફ્લેગ શોધ માટે જંગલી પ્રકારના પ્લાઝમિડ્સથી ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા.e પ્રોબ 3 ની હાજરીમાં કૃત્રિમ પેપ્ટાઇડને શુદ્ધ મિનિએસઓજી સાથે પ્રતિક્રિયા આપવામાં આવી હતી અને Δm +247 અને +229 સાથે સંબંધિત ઉત્પાદનો LC-MS સ્પેક્ટ્રમમાં નોંધવામાં આવ્યા હતા.f miniSOG-6xHis-tag અને anti-6xHis એન્ટિબોડી સાથે મોડલ કરેલ ઇન વિટ્રો પ્રોટીન-ટુ-પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ.એન્ટિબાયોટિન (સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-એચઆરપી) અને મિનિએસઓજી-6xહિસ/એન્ટી-6xહિસ એન્ટિબોડી કોમ્પ્લેક્સનું એન્ટિ-માઉસ વેસ્ટર્ન બ્લોટ વિશ્લેષણ, જે પ્રકાશના સંપર્કના સમયને આધારે પ્રોબ 3 સાથે લેબલ કરેલું છે.વ્યક્તિગત પ્રોટીન માટેના લેબલ્સ અનુરૂપ પરમાણુ વજનમાં વ્યક્ત કરવામાં આવે છે: LC એન્ટિબોડી લાઇટ ચેઇન, HC એન્ટિબોડી હેવી ચેઇન.આ પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે ઓછામાં ઓછા બે વાર સ્વતંત્ર રીતે પુનરાવર્તિત થયા હતા.
લેબલીંગ સાઇટની બાયોકેમિકલ ચકાસણી માટે, માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી દ્વારા ઓળખાયેલ PRDX3 અને PRDX1 ને હિસ્ટીડિનથી એલનાઇનમાં બદલવામાં આવ્યા હતા અને ટ્રાન્સફેક્શન એસેસમાં જંગલી પ્રકાર સાથે સરખામણી કરવામાં આવી હતી.PDPL પરિણામો દર્શાવે છે કે પરિવર્તને લેબલિંગમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો કર્યો છે (ફિગ. 2d).દરમિયાન, ઓપન સર્ચમાં ઓળખવામાં આવેલા પેપ્ટાઈડ સિક્વન્સને પ્રોબ 3 અને બ્લુ લાઇટની હાજરીમાં શુદ્ધ મિનિએસઓજી સાથે વિટ્રોમાં સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને પ્રતિક્રિયા આપવામાં આવી હતી, જ્યારે LC-MS (ફિગ 2e).).મિનિએસઓજી ફોટોએક્ટિવેશનના પ્રતિભાવમાં ઇન્ટરેક્ટીંગ પ્રોક્સિમલ પ્રોટીનને વિટ્રોમાં લેબલ કરી શકાય છે કે કેમ તે ચકાસવા માટે, અમે મિનીએસઓજી-6xહિસ પ્રોટીન અને વિટ્રોમાં એન્ટિ-હિઝ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (આકૃતિ 2f) વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા દ્વારા કૃત્રિમ નિકટતા એસે ડિઝાઇન કરી છે.આ અભ્યાસમાં, અમે મિનિએસઓજી સાથે એન્ટિબોડી હેવી અને લાઇટ ચેઇન્સના પ્રોક્સિમલ લેબલિંગની અપેક્ષા રાખીએ છીએ.વાસ્તવમાં, એન્ટિ-માઉસ (એન્ટિ-6xHis-લેબલવાળી એન્ટિબોડીની ભારે અને હળવી સાંકળોને ઓળખતા) અને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન વેસ્ટર્ન બ્લોટ્સએ ભારે અને હળવા સાંકળોનું મજબૂત બાયોટિનાઇલેશન દર્શાવ્યું હતું.નોંધનીય રીતે, અમે 6xHis ટેગ અને પ્રકાશ અને ભારે સાંકળો વચ્ચેની ક્રોસ-લિંકને કારણે મિનિએસઓજી ઓટોબાયોટીનાઇલેશન નોંધ્યું છે, જે લાયસિન અને 2-ઓક્સો-હિસ્ટીડાઇન પ્રોક્સિમલ રિસ્પોન્સ વચ્ચે અગાઉ વર્ણવેલ ગેપ સાથે સંબંધિત હોઈ શકે છે.નિષ્કર્ષમાં, અમે નિષ્કર્ષ પર આવીએ છીએ કે PDPL નિકટતા આધારિત રીતે હિસ્ટીડાઇનને સુધારે છે.
અમારું આગલું ધ્યેય ઇન સિટુ લેબલિંગની વિશિષ્ટતા ચકાસવા માટે સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમનું લક્ષણ આપવાનું હતું.તેથી, અમે ન્યુક્લિયસ, મિટોકોન્ડ્રીયલ મેટ્રિક્સ, અથવા HEK293T કોશિકાઓના બાહ્ય ER મેમ્બ્રેન (ફિગ. 3a) માં સ્થિરપણે miniSOG વ્યક્ત કર્યું.જેલ ફ્લોરોસેન્સ વિશ્લેષણમાં ત્રણ સબસેલ્યુલર સ્થાનો પર વિપુલ પ્રમાણમાં લેબલવાળા બેન્ડ તેમજ વિવિધ લેબલીંગ પેટર્ન (ફિગ. 3b) જાહેર કરવામાં આવી હતી.ફ્લોરોસેન્સ ઇમેજિંગ વિશ્લેષણ PDPL (ફિગ. 3c) ની ઉચ્ચ વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે.PDPL વર્કફ્લોને ફ્લોરોસેન્સ માઇક્રોસ્કોપીનો ઉપયોગ કરીને સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમને ચિત્રિત કરવા માટે રોડામાઇન ડાયઝ સાથે ક્લિક પ્રતિક્રિયાઓ દ્વારા અનુસરવામાં આવ્યું હતું, અને PDPL સિગ્નલોને DAPI, મિટોકોન્ડ્રીયલ ટ્રેકર્સ અથવા ER ટ્રેકર્સ સાથે સ્થાનિકીકરણ કરવામાં આવ્યું હતું, જે PDPLની ઉચ્ચ વફાદારીની પુષ્ટિ કરે છે.ત્રણ ઓર્ગેનેલ સ્થાનો માટે, એવિડિન વેસ્ટર્ન બ્લોટનો ઉપયોગ કરીને ટર્બોઆઈડી સાથે PDPL ની બાજુ-બાજુની સરખામણી દર્શાવે છે કે PDPL ને તેમના સંબંધિત નિયંત્રણોની તુલનામાં વધુ વિશિષ્ટ રીતે લેબલ કરવામાં આવ્યું હતું.પીડીપીએલ શરતો હેઠળ, વધુ લેબલવાળા બેન્ડ દેખાયા, જે વધુ પીડીપીએલ-લેબલવાળા પ્રોટીન સૂચવે છે (પૂરક ફિગ. 6a-d).
મિનિએસઓજી-મધ્યસ્થી ઓર્ગેનેલ-વિશિષ્ટ પ્રોટીઓમ લેબલિંગની યોજનાકીય રજૂઆત.miniSOG માનવ COX4 (mito-miniSOG) ના N-ટર્મિનલ 23 એમિનો એસિડમાં ફ્યુઝન દ્વારા મિટોકોન્ડ્રીયલ મેટ્રિક્સને લક્ષ્ય બનાવે છે, ન્યુક્લિયસને ફ્યુઝન દ્વારા H2B (ન્યુક્લિયસ-મિનીએસઓજી), અને ER મેમ્બ્રેનની સાયટોપ્લાઝમિક બાજુ (ER-miniSOG) દ્વારા Sec61β. ).સંકેતોમાં જેલ ઇમેજિંગ, કોન્ફોકલ ઇમેજિંગ અને માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રીનો સમાવેશ થાય છે.b ત્રણ ઓર્ગેનેલ-વિશિષ્ટ PDPL પ્રોફાઇલ્સની પ્રતિનિધિ જેલ છબીઓ.CBB Coomassie બ્રિલિયન્ટ બ્લુ.c HEK293T કોશિકાઓની પ્રતિનિધિ કોન્ફોકલ ઈમેજીસ V5 (લાલ) લેબલવાળા એન્ટિબોડી દ્વારા શોધાયેલ વિવિધ સબસેલ્યુલર સ્થાનિકીકરણ સાથે miniSOG ને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરે છે.સબસેલ્યુલર માર્કરનો ઉપયોગ મિટોકોન્ડ્રિયા અને ER (લીલા) માટે થાય છે.PDPL વર્કફ્લોમાં Cy3-azide ક્લિક રસાયણશાસ્ત્રનો ઉપયોગ કરીને miniSOG (પીળા) લેબલવાળા સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમ્સની શોધનો સમાવેશ થાય છે.સ્કેલ બાર: 10 µm.d વિવિધ ઓર્ગેનેલ્સમાં પીડીપીએલ-ટેગ કરેલા પ્રોટીઓમના જ્વાળામુખી પ્લોટ્સ જે લેબલ વગરના પ્રમાણીકરણ (n = 3 સ્વતંત્ર જૈવિક પ્રયોગો) દ્વારા પરિમાણિત છે.જ્વાળામુખીના પ્લોટ પર બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.HEK293T જંગલી પ્રકારનો ઉપયોગ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે થતો હતો. નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા તફાવત). નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા તફાવત). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને > આયનની તીવ્રતામાં 2-ગણો તફાવત).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને > આયનીય શક્તિમાં 2-ગણો તફાવત).સંબંધિત પ્રોટીન HEK293T-miniSOG માટે મહત્વપૂર્ણ છે પરંતુ HEK293T માટે મહત્વપૂર્ણ નથી લીલા રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.e પ્રયોગોમાંથી પ્રોટીઓમિક ડેટાસેટ્સની વિશિષ્ટતાનું વિશ્લેષણ ડી.દરેક ઓર્ગેનેલ (લાલ અને લીલા બિંદુઓ) માં આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર પ્રોટીનની કુલ સંખ્યા ટોચ પર ચિહ્નિત થયેલ છે.હિસ્ટોગ્રામ્સ MitoCarta 3.0, GO વિશ્લેષણ અને A. Ting et al પર આધારિત ઓર્ગેનેલ્સમાં સ્થાનીકૃત પ્રોટીન દર્શાવે છે.લોકોમિટોકોન્ડ્રિયા, ન્યુક્લી અને ER માટે અલગ ડેટાસેટ્સ.આ પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે ઓછામાં ઓછા બે વાર સ્વતંત્ર રીતે પુનરાવર્તિત થયા હતા.કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
જેલ અને ઇમેજિંગ પરિણામો દ્વારા પ્રોત્સાહિત, લેબલ-ફ્રી ક્વોન્ટિફિકેશનનો ઉપયોગ દરેક ઓર્ગેનેલ (પૂરક ડેટા 2) માં ઓળખાયેલ પ્રોટીઓમને માપવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.અનટ્રાન્સફેક્ટેડ HEK293T નો ઉપયોગ પૃષ્ઠભૂમિ માર્કર્સને બાદ કરવા માટે નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો. જ્વાળામુખી પ્લોટ વિશ્લેષણ નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ પ્રોટીન (p <0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા) તેમજ સિંગલટન પ્રોટીન દર્શાવે છે જે ફક્ત miniSOG-વ્યક્ત રેખાઓ (ફિગ. 3d લાલ અને લીલા બિંદુઓ) માં હાજર છે. જ્વાળામુખી પ્લોટ વિશ્લેષણ નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ પ્રોટીન (p <0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા) તેમજ સિંગલટન પ્રોટીન દર્શાવે છે જે ફક્ત miniSOG-વ્યક્ત રેખાઓ (ફિગ. 3d લાલ અને લીલા બિંદુઓ) માં હાજર છે. Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). જ્વાળામુખી પ્લોટ વિશ્લેષણમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ પ્રોટીન (p<0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા) તેમજ સિંગલ પ્રોટીન કે જે માત્ર miniSOG-વ્યક્ત રેખાઓ (ફિગ. 3d, લાલ અને લીલા બિંદુઓ) માં હાજર હોય છે તે દર્શાવ્યું હતું... Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). જ્વાળામુખી પ્લોટ વિશ્લેષણમાં નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ પ્રોટીન (p<0.05 અને >2x આયનીય શક્તિ) તેમજ એકલ પ્રોટીન માત્ર મિનીએસઓજી અભિવ્યક્તિ રેખા (ફિગ. 3d માં લાલ અને લીલા બિંદુઓ) માં હાજર હોવાનું બહાર આવ્યું છે.આ ડેટાને સંયોજિત કરીને, અમે અનુક્રમે 1364, 461, અને 911 આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર ન્યુક્લિયર, મિટોકોન્ડ્રીયલ અને ER બાહ્ય પટલ પ્રોટીન ઓળખ્યા.ઓર્ગેનેલ-સ્થાનિક PDPL ની ચોકસાઈનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, અમે MitoCarta 3.0, જીન ઑન્ટોલોજી (GO) વિશ્લેષણ અને A. Ting et al નો ઉપયોગ કર્યો.73.4, 78.5 અને 73.0% (ફિગ. 3e) ની ચોકસાઈને અનુરૂપ, શોધાયેલ પ્રોટીનની ઓર્ગેનેલ વિશિષ્ટતા ચકાસવા માટે ડેટા સેટ8 નો ઉપયોગ મિટોકોન્ડ્રિયા, ન્યુક્લિયસ અને ER માટે કરવામાં આવ્યો હતો.PDPL ની વિશિષ્ટતા પુષ્ટિ કરે છે કે PDPL એ ઓર્ગેનેલ-વિશિષ્ટ પ્રોટીઓમને ઓળખવા માટે એક આદર્શ સાધન છે.નોંધનીય રીતે, ઓળખાયેલ મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીનના સબમિટોકોન્ડ્રીયલ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ફસાયેલા પ્રોટીઓમ મુખ્યત્વે મેટ્રિક્સ અને આંતરિક પટલ (અનુક્રમે 226 અને 106) માં વિતરિત કરવામાં આવ્યા હતા, જે ઓળખાયેલ મિટોકોન્ડ્રીયલ પ્રોટીનની કુલ સંખ્યાના 91.7% (362) માટે જવાબદાર છે.PDPL ના ઉચ્ચ સ્તરની પણ પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી (પૂરક ફિગ. 7a).એ જ રીતે, સબન્યુક્લિયર વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે કબજે કરાયેલ પ્રોટીઓમ મુખ્યત્વે ન્યુક્લિયસ, ન્યુક્લિયોપ્લાઝમ અને ન્યુક્લિયોલસ (પૂરક ફિગ. 7b) માં વહેંચાયેલું હતું.ન્યુક્લિયર લોકલાઇઝેશન સિગ્નલ પેપ્ટાઇડ (3xNLS) સાથે ન્યુક્લિયર પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણ H2B રચના (પૂરક ફિગ. 7c–h) સમાન ચોકસાઈ દર્શાવે છે.PDPL માર્કરની વિશિષ્ટતા નક્કી કરવા માટે, ન્યુક્લિયર લેમિનિન A ને વધુ વ્યવસ્થિત રીતે સ્થાનિક POI7 ટ્રેપ તરીકે પસંદ કરવામાં આવ્યું હતું.PDPL એ 36 નોંધપાત્ર રીતે સમૃદ્ધ પ્રોટીનની ઓળખ કરી, જેમાંથી 12 પ્રોટીન (લેમિન A સહિત 30.0%) સ્ટ્રિંગ ડેટાબેઝ દ્વારા એનોટેટેડ લેમિન A ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા પ્રોટીન સારી રીતે લાક્ષણિકતા ધરાવતા હતા, જે 28 માંથી 28. , 22.9 બાયોઆઈડી પદ્ધતિ (122 પ્રોટીન) કરતાં ઊંચી ટકાવારી ધરાવે છે. %) 7. અમારી પદ્ધતિએ ઓછા પ્રોટીનની ઓળખ કરી, સંભવતઃ મર્યાદિત લેબલીંગ વિસ્તારોને કારણે, જે વધુ સક્રિય સિંગલ ઓક્સિજન દ્વારા શક્ય બન્યું હતું.GO વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ઓળખાયેલ પ્રોટીન મુખ્યત્વે ન્યુક્લિયોપ્લાઝમ (26), ન્યુક્લિયર મેમ્બ્રેન (10), ન્યુક્લિયર મેમ્બ્રેન (9) અને ન્યુક્લિયર પોર્સ (5) માં સ્થિત હતા.સામૂહિક રીતે, આ પરમાણુ-સ્થાનિક પ્રોટીન સમૃદ્ધ પ્રોટીનના 80% માટે જવાબદાર છે, જે આગળ PDPL (પૂરક ફિગ. 8a–d) ની વિશિષ્ટતા દર્શાવે છે.
ઓર્ગેનેલ્સમાં નિકટતા ચિહ્નિત કરવા માટે PDPL ની ક્ષમતા સ્થાપિત કર્યા પછી, અમે પછી પરીક્ષણ કર્યું કે શું PDPL નો ઉપયોગ POI બંધનકર્તા ભાગીદારોનું વિશ્લેષણ કરવા માટે થઈ શકે છે.ખાસ કરીને, અમે સાયટોસોલિક પ્રોટીનના PDPL વિશ્લેષણને વ્યાખ્યાયિત કરવાનો પ્રયાસ કર્યો, જે તેમના અત્યંત ગતિશીલ સ્વભાવને કારણે તેમના પટલ-સ્થાનિક સમકક્ષો કરતાં વધુ મુશ્કેલ લક્ષ્યો માનવામાં આવે છે.બ્રોમોડોમેન અને એક્સ્ટ્રાટેર્મિનલ (BET) પ્રોટીન BRD4 એ વિવિધ રોગોમાં તેની મુખ્ય ભૂમિકા માટે અમારું ધ્યાન આકર્ષિત કર્યું છે 35, 36.BRD4 દ્વારા રચાયેલ સંકુલ એક ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ કોએક્ટિવેટર અને મહત્વપૂર્ણ રોગનિવારક લક્ષ્ય છે.c-myc અને Wnt5a ટ્રાન્સક્રિપ્શન પરિબળોની અભિવ્યક્તિનું નિયમન કરીને, BRD4 એ એક્યુટ માયલોઇડ લ્યુકેમિયા (AML), મલ્ટિપલ માયલોમા, બર્કિટ લિમ્ફોમા, કોલોન કેન્સર અને બળતરા રોગો 37,38નું મુખ્ય નિર્ણાયક માનવામાં આવે છે.વધુમાં, કેટલાક વાયરસ BRD4 ને વાયરલ અને સેલ્યુલર ટ્રાન્સક્રિપ્શનને નિયંત્રિત કરવા માટે લક્ષ્ય બનાવે છે, જેમ કે પેપિલોમાવાયરસ, HIV અને SARS-CoV-236,39.
PDPL નો ઉપયોગ કરીને BRD4 ક્રિયાપ્રતિક્રિયાને મેપ કરવા માટે, અમે miniSOG ને BRD4 ના ટૂંકા N- અથવા C-ટર્મિનલ આઇસોફોર્મ સાથે જોડી દીધું છે.પ્રોટીઓમિક પરિણામોએ બે રચનાઓ (પૂરક ફિગ. 9a) વચ્ચે ઉચ્ચ ડિગ્રી ઓવરલેપ જાહેર કર્યું.miniSOG-H2B સાથે ઓળખાયેલ ન્યુક્લિયર પ્રોટીઓમ BRD4 (પૂરક ફિગ. 9b) સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા 77.6% પ્રોટીનને આવરી લે છે.પછી, માર્કર ત્રિજ્યા (ફિગ. 4a અને પૂરક ડેટા 3) ને સમાયોજિત કરવા માટે પ્રકાશના વિવિધ સમય (2, 5, 10, 20 મિનિટ) નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.અમે તારણ કાઢીએ છીએ કે ટૂંકા ફોટોપિરિયડ્સ પર, PDPL મુખ્યત્વે ડાયરેક્ટ બાઈન્ડિંગ પાર્ટનર્સને લેબલ કરશે, જ્યારે લાંબા સમયગાળામાં ટૂંકા ફોટોએક્ટિવેશન સમયગાળા દરમિયાન ઓળખવામાં આવેલા પ્રોટીન તેમજ લેબલિંગ કોમ્પ્લેક્સમાં પરોક્ષ લક્ષ્યાંકોનો સમાવેશ થશે.વાસ્તવમાં, અમને નજીકના સમય બિંદુઓ વચ્ચે મજબૂત ઓવરલેપ જોવા મળ્યું (2 અને 5 મિનિટ માટે 84.6%; 5 અને 10 મિનિટ માટે 87.7%; 10 અને 20 મિનિટ માટે 98.7%) (ફિગ. 4b અને પૂરક ફિગ. 9c ).તમામ પ્રાયોગિક જૂથોમાં, અમને માત્ર BRD4 સ્વ-લેબલિંગ જ નહીં, પરંતુ MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, અને HMGB1 જેવા ઘણા જાણીતા લક્ષ્યો સ્ટ્રિંગ ડેટાબેઝમાં નોંધાયેલા મળ્યાં છે.આ લક્ષ્યોની આયનીય શક્તિ એક્સપોઝર સમય (ફિગ. 4c અને પૂરક ફિગ. 9d) માટે પ્રમાણસર છે.2-મિનિટના જૂથમાં ઓળખાયેલ પ્રોટીનના GO વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે ઓળખાયેલ પ્રોટીન ન્યુક્લિયસમાં સ્થાનીકૃત હતા અને ક્રોમેટિન રિમોડેલિંગ અને આરએનએ પોલિમરેઝ કાર્યમાં સામેલ હતા.પ્રોટીનનું પરમાણુ કાર્ય ક્રોમેટિન બંધનકર્તા અથવા ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ કોએક્ટિવેશનમાં સમૃદ્ધ હતું, જે BRD4 કાર્ય (ફિગ. 4d) સાથે સુસંગત હતું.સ્ટ્રિંગ ડેટાબેઝ-સક્ષમ પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા વિશ્લેષણમાં BRD4 અને HDAC ફેમિલી ઇન્ટરેક્ટિંગ કોમ્પ્લેક્સ જેમ કે SIN3A, NCOR2, BCOR, અને SAP130 (ફિગ. 4e અને પૂરક ફિગ. 9e) વચ્ચેની પરોક્ષ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું પ્રથમ સ્તર બહાર આવ્યું છે, જે BRD4 અને HDAC સાથે સુસંગત છે. ..વધુમાં, LC-MS/MS દ્વારા ઓળખવામાં આવેલા પ્રતિનિધિ લક્ષ્યો, જેમાં Sin3A, NSUN2, Fus, અને SFPQ, વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ (ફિગ. 4f) દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી.તાજેતરમાં, BRD4 ના ટૂંકા આઇસોફોર્મ લિક્વિડ-લિક્વિડ ફેઝ સેપરેશન (LLPS) પ્રોપર્ટીઝ સાથે ન્યુક્લી બનાવવાની જાણ કરવામાં આવી છે.RNA બંધનકર્તા પ્રોટીન્સ Fus અને SFPQ વિવિધ સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓની LLPS માં મધ્યસ્થી કરે છે અને અહીં બિન-રેકોર્ડેડ BRD4 બંધનકર્તા પ્રોટીન તરીકે ઓળખવામાં આવ્યા છે.BRD4 અને SFPQ વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની પુષ્ટિ કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન (કો-આઈપી) પ્રયોગો (આકૃતિ 4g) દ્વારા કરવામાં આવી હતી, જે વધુ તપાસને લાયક BRD4-મધ્યસ્થી પ્રવાહી-પ્રવાહી તબક્કાના વિભાજન માટેની બીજી પદ્ધતિ સૂચવે છે.એકસાથે લેવામાં આવે તો, આ પરિણામો સૂચવે છે કે PDPL જાણીતા BRD4 ઇન્ટરેક્ટિંગ તેમજ અજાણ્યા બંધનકર્તા પ્રોટીનને ઓળખવા માટે એક આદર્શ પ્લેટફોર્મ છે.
મિનિએસઓજી-મધ્યસ્થી BRD4 પ્રોક્સિમિટી માર્કિંગ, એક્સપોઝર ટાઇમ્સનું યોજનાકીય રજૂઆત: 2, 5, 10 અને 20 મિનિટ.b અલગ અલગ રોશની સમયે ઓળખાયેલ પ્રોટીનનું ઓવરલેપ.HEK293T-miniSOG-BRD4 માં ઓળખાયેલ પ્રોટીન સંવર્ધન જંગલી પ્રકારના HEK293T ની તુલનામાં આંકડાકીય રીતે નોંધપાત્ર હતું.c સ્પષ્ટ એક્સપોઝર સમય દરમિયાન લેબલ વગરના પ્રતિનિધિ જાણીતા BRD4-બંધનકર્તા પ્રોટીનનું પ્રમાણ નક્કી કરતી વખતે આયનની તીવ્રતા.n = 3 જૈવિક રીતે સ્વતંત્ર નમૂનાઓ.ડેટા સરેરાશ ± માનક વિચલન તરીકે રજૂ કરવામાં આવે છે.d 2-મિનિટના જૂથમાં ઓળખાયેલ પ્રોટીનનું જીન ઓન્ટોલોજીકલ વિશ્લેષણ (GO).પ્રથમ દસ GO શરતો સૂચિબદ્ધ છે.GO ટર્મ કેટેગરી અનુસાર બબલ્સ રંગીન હોય છે, અને બબલનું કદ દરેક ટર્મમાં મળી આવતા પ્રોટીનની સંખ્યાના પ્રમાણમાં હોય છે.e BRD4 સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતા પ્રોટીનનું સ્ટ્રિંગ વિશ્લેષણ.પીળા વર્તુળો સીધા ગુંદર છે અને ગ્રે વર્તુળો પરોક્ષ ગુંદરનું પ્રથમ સ્તર છે.લાલ રેખાઓ પ્રાયોગિક રીતે નિર્ધારિત ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે અને વાદળી રેખાઓ અનુમાનિત ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓનું પ્રતિનિધિત્વ કરે છે.f LC-MS/MS માં ઓળખાયેલ પ્રતિનિધિ BRD4 બંધનકર્તા લક્ષ્યો પશ્ચિમી બ્લોટિંગ દ્વારા ચકાસવામાં આવ્યા હતા.g કો-ઇમ્યુનોપ્રિસિપિટેશન પ્રયોગો SFPQ અને BRD4 વચ્ચેની ક્રિયાપ્રતિક્રિયાની પુષ્ટિ કરે છે.આ પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે ઓછામાં ઓછા બે વાર સ્વતંત્ર રીતે પુનરાવર્તિત થયા હતા.કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
બિન-નોંધાયેલ POI-સંબંધિત લક્ષ્યોને ઓળખવા ઉપરાંત, અમે અનુમાન કરીએ છીએ કે PDPL એન્ઝાઇમ્સ માટે સબસ્ટ્રેટ્સ ઓળખવા માટે યોગ્ય હશે, જેને બિન-નોંધાયેલ સબસ્ટ્રેટ્સને ટીકા કરવા માટે મોટા સંકુલમાં પરોક્ષ બંધનકર્તા પ્રોટીનની લાક્ષણિકતાની જરૂર પડશે.પાર્કિન (PARK2 દ્વારા એન્કોડેડ) એ E3 લિગેઝ છે અને પાર્કિનમાં પરિવર્તન ઓટોસોમલ રિસેસિવ જુવેનાઈલ પાર્કિન્સન રોગ (AR-JP)42 માટે જાણીતું છે.વધુમાં, પાર્કિનને મિટોફેજી (મિટોકોન્ડ્રીયલ ઓટોફેજી) અને પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિઓને દૂર કરવા માટે આવશ્યક તરીકે વર્ણવવામાં આવ્યું છે.જો કે, ઘણા પાર્કિન સબસ્ટ્રેટને ઓળખવામાં આવ્યા હોવા છતાં, આ રોગમાં પાર્કિનની ભૂમિકા અસ્પષ્ટ રહે છે.તેના અવિભાજિત સબસ્ટ્રેટની ટીકા કરવા માટે, પાર્કિનના N- અથવા C-ટર્મિનસમાં miniSOG ઉમેરીને PDPL નું પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું.PINK1-પાર્કિન પાથવે દ્વારા પાર્કિનને સક્રિય કરવા માટે કોષોને કાર્બોનિલ સાયનાઇડ પ્રોટોન ટ્રાન્સપોર્ટર એમ-ક્લોરોફેનિલહાઇડ્રેઝોન (CCCP) સાથે સારવાર આપવામાં આવી હતી.અમારા BRD4 PDPL પરિણામોની તુલનામાં, પાર્કિન એન-ટર્મિનસ ફ્યુઝન એ લક્ષ્ય પ્રોટીનનો મોટો સમૂહ જાહેર કર્યો, જો કે તે C-ટર્મિનસ (210 માંથી 177) (આકૃતિ 5a,b અને પૂરક ડેટા 4) ના મોટા ભાગને આવરી લે છે.પરિણામ એ અહેવાલો સાથે સુસંગત છે કે N-ટર્મિનલ ટૅગ્સ પાર્કિન44ને અસ્પષ્ટ રીતે સક્રિય કરી શકે છે.આશ્ચર્યજનક રીતે, Parkin43 માટે પ્રકાશિત AP-MS પરિણામો સાથે અમારા ડેટામાં માત્ર 18 ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન હતા, સંભવતઃ સેલ લાઇન અને પ્રોટીઓમિક્સ વર્કફ્લો વચ્ચેના તફાવતને કારણે.ચાર જાણીતા પ્રોટીન ઉપરાંત (ARDM1, HSPA8, PSMD14, અને PSMC3) બે પદ્ધતિઓ દ્વારા ઓળખવામાં આવે છે (ફિગ. 5c)43.એલસી-એમએસ/એમએસના પરિણામોને વધુ માન્ય કરવા માટે, પીડીપીએલ સારવાર અને અનુગામી વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગનો ઉપયોગ HEK293T પેરેન્ટ સેલ એસે અને સ્થિર એન-ટર્મિનલ પાર્કિન લાઇનના પરિણામોની તુલના કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.અગાઉ અજાણ્યા લક્ષ્યો CDK2, DUT, CTBP1, અને PSMC4 નું પરીક્ષણ જાણીતા બાઈન્ડર, DNAJB1 (ફિગ. 5d) સાથે કરવામાં આવ્યું હતું.
HEK293T કોષોમાં પાર્કિન-ઇન્ટરેક્ટિંગ પ્રોટીનનો જ્વાળામુખી પ્લોટ પાર્કિનના N- અથવા C-ટર્મિનસ (n = 3 સ્વતંત્ર જૈવિક પ્રયોગો) સાથે સ્થિર રીતે વ્યક્ત મિનિએસઓજી સાથે જોડાયેલો છે.જ્વાળામુખીના પ્લોટ પર બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.HEK293T નો ઉપયોગ નકારાત્મક નિયંત્રણ તરીકે થતો હતો. નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા તફાવત). નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને >2-ગણો આયન તીવ્રતા તફાવત). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને > આયનની તીવ્રતામાં 2-ગણો તફાવત).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). નોંધપાત્ર રીતે બદલાયેલ પ્રોટીન લાલ રંગમાં પ્રકાશિત થાય છે (p <0.05 અને > આયનીય શક્તિમાં 2-ગણો તફાવત).સંબંધિત પ્રોટીન HEK293T-miniSOG માટે મહત્વપૂર્ણ છે પરંતુ HEK293T માટે મહત્વપૂર્ણ નથી લીલા રંગમાં દર્શાવવામાં આવ્યા છે.b વેન ડાયાગ્રામ એન-ટર્મિનલ અને સી-ટર્મિનલ બાંધકામો વચ્ચે ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન દર્શાવે છે.એન-ટર્મિનલ ટૅગ્સ અસ્પષ્ટપણે પાર્કિનને સક્રિય કરી શકે છે અને વધુ ઓળખી શકાય તેવા પ્રોટીનમાં પરિણમે છે.c વેન ડાયાગ્રામ PDPL અને AP-MS વચ્ચે ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન દર્શાવે છે.જાણીતા ઇન્ટરેક્ટર્સ સૂચિબદ્ધ છે, જેમાં 18 માંથી 4 ઓવરલેપિંગ પ્રોટીન અને 159 માંથી 11 પ્રોટીન ખાસ કરીને PDPL માં ઓળખાય છે.LC-MS/MS દ્વારા ઓળખવામાં આવેલા પ્રતિનિધિ લક્ષ્યોને પશ્ચિમી બ્લોટિંગ દ્વારા ચકાસવામાં આવ્યા હતા.e Ssu72 અને SNW1 ને બિન નોંધાયેલ પાર્કિન સબસ્ટ્રેટ તરીકે ઓળખવામાં આવ્યા હતા.આ ફ્લેગ-ટેગવાળા પ્રોટીન પ્લાઝમિડ્સને HEK293T અને HEK293T-પાર્કિન-મિનીએસઓજીમાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા અને ત્યારબાદ વિવિધ સમયના બિંદુઓ પર CCCP સારવાર આપવામાં આવી હતી.પાર્કિન ઓવરએક્સપ્રેશન લાઇનમાં અધોગતિ વધુ સ્પષ્ટ હતી.f પ્રોટીઝોમ અવરોધક MG132 નો ઉપયોગ કરીને, તે પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી કે Ssu72 અને SNW1 ની અધોગતિ પ્રક્રિયા પ્રોટીઝોમ-સર્વવ્યાપકતા દ્વારા મધ્યસ્થી થાય છે.આ પ્રયોગો સમાન પરિણામો સાથે ઓછામાં ઓછા બે વાર સ્વતંત્ર રીતે પુનરાવર્તિત થયા હતા.કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.
નોંધનીય રીતે, PDPL દ્વારા ઓળખવામાં આવેલા પ્રોટીનમાં પાર્કિન-બંધનકર્તા પ્રોટીન અને તેમના સબસ્ટ્રેટનો સમાવેશ થવો જોઈએ.બિન-નોંધાયેલ પાર્કિન સબસ્ટ્રેટને શોધવા માટે, અમે આ જનીનોને સામાન્ય HEK293Tમાં ખુલ્લા પાડવા માટે સાત ઓળખાયેલ પ્રોટીન (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 અને SNW1) અને ટ્રાન્સફેક્ટેડ પ્લાઝમિડ્સ પસંદ કર્યા અને મિનિએસઓજી-પાર્કિનની સારવારને અનુસરીને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કર્યા.સ્થિર મિનીએસઓજી-પાર્કિન લાઇન (ફિગ. 5e) માં Ssu72 અને SNW1 પ્રોટીનના સ્તરમાં નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો હતો.CCCP સાથે 12 કલાક સુધી સારવાર કરવાથી બંને સબસ્ટ્રેટમાં સૌથી વધુ નોંધપાત્ર ઘટાડો થયો.Ssu72 અને SNW1 ના અધોગતિને પ્રોટીઝોમ-યુબિક્વિટીનેશન દ્વારા નિયંત્રિત કરવામાં આવે છે કે કેમ તે તપાસવા માટે, પ્રોટીઝોમ પ્રવૃત્તિને રોકવા માટે પ્રોટીઝોમ અવરોધક MG132 ઉમેરવામાં આવ્યું હતું, અને વાસ્તવમાં અમને જાણવા મળ્યું હતું કે તેમની અધોગતિ પ્રક્રિયાને અવરોધે છે (ફિગ. 5f).વેસ્ટર્ન બ્લોટિંગ (પૂરક ફિગ. 10) નો ઉપયોગ કરીને પાર્કિન ઇન્ટરેક્ટર્સ તરીકે વધારાના બિન-સબસ્ટ્રેટ લક્ષ્યોની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી, જેણે LC-MS/MS સાથે સુસંગત પરિણામો દર્શાવ્યા હતા.નિષ્કર્ષમાં, PDPL વર્કફ્લોનું લક્ષ્ય પ્રોટીન ટ્રાન્સફેક્શન વેરિફિકેશન સાથેનું એકીકરણ અનરજિસ્ટર્ડ E3 લિગેસ સબસ્ટ્રેટ્સને ઓળખવાની મંજૂરી આપે છે.
અમે એક સામાન્ય નિકટતા માર્કિંગ પ્લેટફોર્મ વિકસાવ્યું છે જે તમને જગ્યા અને સમયની ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરતી POI ને ઓળખવાની મંજૂરી આપે છે.પ્લેટફોર્મ મિનિએસઓજી ફોટોસેન્સિટાઇઝર પ્રોટીન પર આધારિત છે, જે માત્ર 12 kDa છે, જે પરિપક્વ APEX2 એન્ઝાઇમ (27 kDa) ના અડધા કરતા પણ ઓછું છે અને TurboID (35 kDa) ના કદ કરતાં ત્રીજા ભાગનું છે.નાના કદમાં નાના પ્રોટીન ઇન્ટરેક્ટોમ્સનો અભ્યાસ કરવા માટે એપ્લિકેશનની શ્રેણીને મોટા પ્રમાણમાં વિસ્તૃત કરવી જોઈએ.સિંગલટ ઓક્સિજનની ક્વોન્ટમ યીલ્ડ વધારવા અને આ અભિગમની સંવેદનશીલતાને વિસ્તૃત કરવા માટે વધારાના ફોટોસેન્સિટાઇઝર્સનું વધુ સંશોધન, પછી ભલેને આનુવંશિક રીતે એન્કોડેડ પ્રોટીન હોય કે નાના અણુઓ.miniSOG ના વર્તમાન સંસ્કરણ માટે, નિકટતા માર્કર્સને સક્રિય કરવા માટે વાદળી પ્રકાશનો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ ટેમ્પોરલ રીઝોલ્યુશન પ્રાપ્ત કરી શકાય છે.વધુમાં, લાંબા સમય સુધી એક્સપોઝર ટાઈમે સિંગલ ઓક્સિજનનો મોટો "વાદળ" છોડ્યો, જેના પરિણામે વધુ દૂરવર્તી હિસ્ટીડાઈન અવશેષોમાં ફેરફાર થયો, લેબલીંગ ત્રિજ્યામાં વધારો થયો અને PDPL અવકાશી રીઝોલ્યુશનને ફાઈન-ટ્યુન કરવાની ક્ષમતા.અમે સિગ્નલ-ટુ-બેકગ્રાઉન્ડ રેશિયો વધારવા માટે સાત રાસાયણિક પ્રોબ્સનું પણ પરીક્ષણ કર્યું અને આ અભિગમ પાછળના મોલેક્યુલર મિકેનિઝમની શોધ કરી.TOP-ABPP વર્કફ્લો નિષ્પક્ષ ખુલ્લી શોધ સાથે મળીને પુષ્ટિ કરે છે કે ફેરફારો ફક્ત હિસ્ટીડાઇન્સમાં જ થયા છે અને હિસ્ટીડાઇન ફેરફારો માટે કોઈ સુસંગત સૂક્ષ્મ વાતાવરણ જોવા મળ્યું નથી, સિવાય કે લૂપ પ્રદેશમાં હિસ્ટિડાઇન્સની મધ્યમ પસંદગી સિવાય.
PDPL નો ઉપયોગ પ્રોટીઓમ વિશિષ્ટતા અને કવરેજ સાથે સબસેલ્યુલર પ્રોટીઓમને લાક્ષણિકતા આપવા માટે પણ કરવામાં આવ્યો છે જે ઓછામાં ઓછા અન્ય નિકટતા લેબલીંગ અને ઓર્ગેનેલ-વિશિષ્ટ રાસાયણિક તપાસ પદ્ધતિઓ સાથે તુલનાત્મક છે.સપાટી, લિસોસોમલ અને સિક્રેટોમ-સંબંધિત પ્રોટીઓમ 46,47 ને દર્શાવવા માટે નિકટતા માર્કર્સનો પણ સફળતાપૂર્વક ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે.અમે માનીએ છીએ કે PDPL આ સબસેલ્યુલર ઓર્ગેનેલ્સ સાથે સુસંગત હશે.વધુમાં, અમે સાયટોસોલિક પ્રોટીન બાઈન્ડિંગ માટેના લક્ષ્યોને ઓળખીને PDPLને પડકાર્યો છે જે તેમના ગતિશીલ ગુણધર્મો અને વધુ ટેમ્પોરલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓમાં સામેલ થવાને કારણે મેમ્બ્રેન બાઉન્ડ પ્રોટીન કરતાં વધુ જટિલ છે.PDPL બે પ્રોટીન, ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ કોએક્ટિવેટર BRD4 અને રોગ સાથે સંકળાયેલ લિગેસ E3 પાર્કિન પર લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું.આ બે પ્રોટીન માત્ર તેમના મૂળભૂત જૈવિક કાર્યો માટે જ નહીં, પણ તેમની ક્લિનિકલ સુસંગતતા અને રોગનિવારક સંભવિતતા માટે પણ પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા.આ બે POI માટે, જાણીતા બંધનકર્તા ભાગીદારો તેમજ બિન નોંધાયેલ લક્ષ્યો ઓળખવામાં આવ્યા હતા.નોંધનીય રીતે, ફેઝ સેપરેશન-સંબંધિત પ્રોટીન SFPQ ની કો-આઈપી દ્વારા પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી, જે એક નવી પદ્ધતિ સૂચવી શકે છે જેના દ્વારા BRD4 (ટૂંકા આઇસોફોર્મ) LLPS ને નિયંત્રિત કરે છે.તે જ સમયે, અમે માનીએ છીએ કે પાર્કિન સબસ્ટ્રેટ્સની ઓળખ એ એક દૃશ્ય છે જેમાં પરોક્ષ એડહેસિવ્સની ઓળખ જરૂરી છે.અમે બે અજાણ્યા પાર્કિન સબસ્ટ્રેટને ઓળખ્યા અને સર્વવ્યાપકતા-પ્રોટીઝોમ પાથવે સાથે તેમના અધોગતિની પુષ્ટિ કરી.તાજેતરમાં, હાઇડ્રોલેઝ સબસ્ટ્રેટને ઉત્સેચકો સાથે ફસાવીને તેમને શોધવા માટે મિકેનિઝમ-આધારિત ટ્રેપિંગ વ્યૂહરચના વિકસાવવામાં આવી છે.જો કે આ એક ખૂબ જ શક્તિશાળી પદ્ધતિ છે, તે મોટા સંકુલની રચનામાં સામેલ સબસ્ટ્રેટના વિશ્લેષણ માટે યોગ્ય નથી અને એન્ઝાઇમ અને સબસ્ટ્રેટ વચ્ચે સહસંયોજક બોન્ડની રચનાની જરૂર છે.અમે અપેક્ષા રાખીએ છીએ કે પીડીપીએલને અન્ય પ્રોટીન સંકુલ અને એન્ઝાઇમ પરિવારોનો અભ્યાસ કરવા માટે વિસ્તૃત કરી શકાય છે, જેમ કે ડીયુબીક્વિટીનેઝ અને મેટાલોપ્રોટીઝ પરિવારો.
SOPP3 નામનું મિનીએસઓજીનું નવું સ્વરૂપ, સિંગલ ઓક્સિજનના સુધારેલા ઉત્પાદન સાથે વિકસાવવામાં આવ્યું છે.અમે SOPP3 સાથે miniSOG ની સરખામણી કરી અને માર્કિંગ પરફોર્મન્સમાં સુધારો જોવા મળ્યો, જોકે સિગ્નલ-ટુ-નોઈઝ રેશિયો યથાવત રહ્યો (પૂરક ફિગ. 11).અમે અનુમાન કર્યું છે કે SOPP3 નું ઑપ્ટિમાઇઝેશન (દા.ત., નિર્દેશિત ઉત્ક્રાંતિ દ્વારા) વધુ કાર્યક્ષમ ફોટોસેન્સિટાઇઝર પ્રોટીન તરફ દોરી જશે જેને ઓછા પ્રકાશ સમયની જરૂર પડે છે અને આમ વધુ ગતિશીલ સેલ્યુલર પ્રક્રિયાઓને પકડવાની મંજૂરી આપે છે.નોંધનીય રીતે, PDPL નું વર્તમાન સંસ્કરણ સેલ્યુલર પર્યાવરણ પૂરતું મર્યાદિત છે કારણ કે તેને વાદળી પ્રકાશની જરૂર છે અને તે ઊંડા પેશીઓમાં પ્રવેશ કરી શકતી નથી.આ લક્ષણ એનિમલ મોડલ અભ્યાસમાં તેનો ઉપયોગ અટકાવે છે.જો કે, પીડીપીએલ સાથે ઓપ્ટોજેનેટિક્સનું સંયોજન ખાસ કરીને મગજમાં પ્રાણીઓના સંશોધન માટે તક પૂરી પાડી શકે છે.આ ઉપરાંત, અન્ય એન્જિનિયર્ડ ઇન્ફ્રારેડ ફોટોસેન્સિટાઇઝર્સ પણ આ મર્યાદાને દૂર કરે છે.હાલમાં આ ક્ષેત્રમાં સંશોધન ચાલી રહ્યું છે.
HEK293T સેલ લાઇન ATCC (CRL-3216) માંથી મેળવવામાં આવી હતી.સેલ લાઇનમાં માયકોપ્લાઝ્મા ચેપ માટે નકારાત્મક પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને 10% ફેટલ બોવાઇન સીરમ (FBS, Vistech, #SE100-B) અને 1% પેનિસિલિન/સ્ટ્રેપ્ટોમાસીન (હાયક્લોન, #SV3) સાથે પૂરક DMEM (થર્મો, #C11995500BT) માં સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું.માં ઉછર્યા.
3-એમિનોફેનાઇલ (નમૂનો 3) અને (4-ઇથિનાઇલફેનાઇલ) મિથેનામાઇન (નમૂનો 4) બિડેફાર્મ પાસેથી ખરીદવામાં આવ્યા હતા.પ્રોપાયલામાઈન (પ્રોબ 2) એનર્જી-કેમિકલ્સમાંથી ખરીદવામાં આવી હતી.N-(2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) પ્રકાશિત પદ્ધતિઓ અનુસાર સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
પૂરક કોષ્ટક 1 આ અભ્યાસમાં વપરાતા આનુવંશિક રચનાઓની યાદી આપે છે.મિનિએસઓજી અને કિલર રેડ સિક્વન્સને પી. ઝૂ (પેકિંગ યુનિવર્સિટી) તરફથી ભેટ પ્લાઝમિડમાંથી ક્લોન કરવામાં આવ્યા હતા.મિટોકોન્ડ્રીયલ મેટ્રિક્સ લક્ષ્યાંક ક્રમ COX4 ના 23 એન-ટર્મિનલ એમિનો એસિડમાંથી મેળવવામાં આવ્યો હતો અને ગિબ્સન એસેમ્બલી (બેયોટાઇમ, #D7010S) નો ઉપયોગ કરીને સૂચવેલા વેક્ટર્સમાં ક્લોન કરવામાં આવ્યો હતો.એન્ડોપ્લાઝમિક રેટિક્યુલમના મેમ્બ્રેન અને ન્યુક્લિયસને લક્ષ્ય બનાવવા માટે, HEK293T કોષોની cDNA લાઇબ્રેરીમાંથી PCR દ્વારા એમ્પ્લીફાઇડ SEC61B માનવ DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L), અને H2B DNA (ડી. લિન, બા શેનઝેન દ્વારા દાન કરાયેલ) અને ઉપર જણાવ્યા મુજબ ક્લોન કરેલ છે.જ્યાં સુધી અન્યથા સૂચવવામાં ન આવે ત્યાં સુધી, સ્થિર કોષ રેખાઓના ટ્રાન્સફેક્શન અને નિર્માણ માટે ઉપયોગમાં લેવાતા અન્ય પ્રોટીન જનીનો HEK293T સેલ cDNA લાઇબ્રેરીમાંથી PCR એમ્પ્લીફાઇડ કરવામાં આવ્યા હતા.G3S (GGGS) અને G4S (GGGGS) નો ઉપયોગ બાઈટ પ્રોટીન અને મિનીએસઓજી વચ્ચેના જોડાણ તરીકે થતો હતો.આ ફ્યુઝન રચનાઓમાં V5 એપિટોપ ટેગ (GKPIPNPLLGLDST) ઉમેરવામાં આવ્યો હતો.સસ્તન પ્રાણીઓમાં અભિવ્યક્તિ માટે અને સ્થિર કોષ રેખા સ્થાપિત કરવા માટે, મિનિએસઓજી ફ્યુઝન કન્સ્ટ્રક્ટને pLX304 લેન્ટીવાયરલ વેક્ટરમાં સબક્લોન કરવામાં આવ્યું હતું.બેક્ટેરિયલ અભિવ્યક્તિ માટે, miniSOG ને C-ટર્મિનસ પર 6xHis લેબલવાળા pET21a વેક્ટરમાં ક્લોન કરવામાં આવ્યું હતું.
HEK293T કોષોને છ-વેલ પ્લેટમાં કૂવા દીઠ 2.0 x 105 કોષો પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા અને 24 કલાક પછી રિકોમ્બિનન્ટ લેન્ટીવાયરલ પ્લાઝમિડ્સ (2.4 μg pLX304) અને વાયરલ પેકેજિંગ પ્લાઝમિડ્સ (1.5 μg psPAX2 અને 1.2 pMD20g08 સાથે લિબીપોજી ટાઇમ) સાથે ટ્રાન્સફેક્ટ કરવામાં આવ્યા હતા. , #C0533), લગભગ 80% ફ્યુઝન.રાતોરાત ટ્રાન્સફેક્શન પછી, માધ્યમ બદલાઈ ગયું અને બીજા 24 કલાક માટે સેવન કરવામાં આવ્યું.વાયરસનો સંગ્રહ 24, 48 અને 72 કલાક પછી હાથ ધરવામાં આવ્યો હતો.લક્ષ્ય કોષ રેખાઓના ચેપ પહેલા, વાયરલ માધ્યમને 0.8 μm ફિલ્ટર (મર્ક, #મિલેક્સ-જીપી) દ્વારા ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું અને પોલિબ્રેન (સોલાર્બિયો, #H8761) 8 μg/ml ની સાંદ્રતામાં ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.24 કલાક પછી, માધ્યમ બદલીને કોષોને પુનઃપ્રાપ્ત કરવાની મંજૂરી આપવામાં આવી હતી.નીચલા કડક પસંદગી તરીકે પ્રથમ ત્રણ ફકરાઓ માટે 5 μg/ml બ્લાસ્ટિસિડિન (સોલાર્બિયો, #3513-03-9) નો ઉપયોગ કરીને કોષો પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા.ત્યારપછી આગામી ત્રણ પેસેજ માટે 20 μg/ml વધુ કડક પદ્ધતિ તરીકે ઉપયોગમાં લેવાય છે.
કોષોને 12-કુવા ચેમ્બરમાં (Ibidi, #81201) આશરે 20,000 કોષોની ઘનતા પર પ્રતિ કૂવામાં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા.HEK293T કોષોના સંલગ્નતામાં સુધારો કરવા માટે, 37 °C પર ફોસ્ફેટ બફર કરેલ ખારા (PBS, Sangon, #B640435) માં 50 µg/ml ફાઈબ્રોનેક્ટીન (કોર્નિંગ, #356008) ભેળવવામાં આવે છે.ચેમ્બર્સને 1 કલાક માટે પ્રીટ્રીટ કરવામાં આવ્યા હતા અને પછી પીબીએસ સાથે દૂર કરવામાં આવ્યા હતા.24 કલાક પછી, કોષોને પીબીએસ વડે એકવાર ધોવામાં આવ્યા, તાજા હેન્ક્સના સંતુલિત સોલ્ટ સોલ્યુશન (એચબીએસએસ, ગીબકો, #14025092) માં 1 એમએમ પ્રોબ 3 સાથે 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ તાપમાને 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા, અને પછી વાદળી એલઇડી (460 એનએમ) સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા. ).) ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે ઇરેડિયેટ કરવામાં આવ્યા હતા.તે પછી, કોષોને પીબીએસ વડે બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને 15 મિનિટ માટે પીબીએસ (સાંગોન, #E672002) માં 4% ફોર્માલ્ડિહાઇડ સાથે ફિક્સ કરવામાં આવ્યા હતા.PBS સાથે ત્રણ વખત ધોવાથી નિશ્ચિત કોષોમાંથી વધારાનું ફોર્માલ્ડિહાઇડ દૂર કરવામાં આવ્યું હતું.ત્યારબાદ કોષોને પીબીએસમાં 0.5% ટ્રાઇટોન X-100 (સાંગોન, #A600198) વડે અભેદ્ય બનાવવામાં આવ્યા હતા અને પીબીએસ સાથે 3 વખત ધોવાયા હતા.પછી ચેમ્બરને દૂર કરો અને 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ધરાવતા ક્લિક પ્રતિક્રિયા મિશ્રણના 25 µl દરેક નમૂનામાં ઉમેરો. અને 0.5 મિલિગ્રામ/એમએલ સોડિયમ એસ્કોર્બેટ (અલાદ્દીન, નં. S105024) અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવે છે.ત્વરિત પ્રતિક્રિયા પછી, કોષોને 0.05% ટ્વીન-20 (સાંગોન, #A600560) (PBST) ધરાવતા PBS સાથે છ વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને પછી ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે PBST માં 5% BSA (Abcone, #B24726) સાથે અવરોધિત કરવામાં આવ્યા હતા.
કોલોકલાઇઝેશન ઇમ્યુનોસ્ટેનિંગ માટે, સૂચવેલ શરતો અનુસાર કોષોને પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા: માઉસ એન્ટિ-વી5 ટેગ mAb (1:500, CST, #80076), સસલું એન્ટિ-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), રેબિટ પોલીક્લોનલ એન્ટિ-કેલનેક્સિન એન્ટિબોડી (1:500, એબકેમ, #ab22595) અથવા રેબિટ એન્ટિ-લેમિન A/C મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (1:500; CST, #2032) રાતોરાત 4 °C પર.PBST સાથે 3 વખત ધોવા પછી, સેકન્ડરી એન્ટિબોડીઝ સાથે કોષો ઉકાળવામાં આવ્યા હતા: બકરી વિરોધી રેબિટ એલેક્સા ફ્લોર 488 (થર્મો, #A11034) 1:1000 પાતળું, બકરી વિરોધી માઉસ એલેક્સા ફ્લોર 594 (CST, #8889) 1:100 પાતળું.મંદન 30 મિનિટ માટે ઓરડાના તાપમાને પાતળું.ત્યારબાદ કોષોને PBST વડે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે PBS માં DAPI (થર્મો, #D1306) સાથે કાઉન્ટરસ્ટેઈન કરવામાં આવ્યા હતા.પીબીએસ સાથે 3 ધોવા પછી, ઇમેજિંગ માટે પીબીએસમાં 50% ગ્લિસરોલ (સાંગોન, #A600232) માં કોષોને સીલ કરવામાં આવ્યા હતા.ZEISS LSM 900 Airyscan2 કોન્ફોકલ માઈક્રોસ્કોપ અને ZNE 3.5 સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોફ્લોરોસન્ટ ઈમેજો મેળવવામાં આવી હતી.
સિંગલ ઓક્સિજન ફ્લોરોસન્ટ ઇમેજિંગ માટે, હેન્ક્સ HEPES બફર (DOJINDO, #MT05) માં 100 nM Si-DMA ઉમેરતા પહેલા કોષોને હેન્ક્સ HEPES બફર સાથે બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા.પ્રકાશના સંપર્કમાં આવ્યા પછી, કોષોને CO2 ઇન્ક્યુબેટરમાં 37°C પર 45 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.ત્યારપછી હેન્ક્સના HEPES બફરથી કોષોને બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે હેન્ક્સના HEPES બફરમાં Hoechst સાથે કાઉન્ટરસ્ટેઈન કરવામાં આવ્યા હતા અને ZEISS LSM 900 કોન્ફોકલ માઈક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યા હતા., #M36008) કેલ્શિયમ અને મેગ્નેશિયમ ધરાવતા HBSS બફરમાં.પ્રકાશ અથવા ડોક્સોરુબીસિન (MCE, #HY-15142A) ના સંપર્કમાં આવ્યા પછી, કોષોને CO2 ઇન્ક્યુબેટરમાં 37 ° સે. પર 10 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા, HBSS બફરથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા, અને ઓરડાના તાપમાને HBSS બફરમાં Hoechst સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.મિનિટડોક્સોરુબિસિનનો ઉપયોગ હકારાત્મક ચકાસણી નિયંત્રણ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો જ્યાં 30 મિનિટ માટે 1% BSA ધરાવતા HBSS માં 20 μM ડોક્સોરુબિસિન સાથે કોષોની સારવાર કરવામાં આવી હતી.Zeiss LSM 900 કોન્ફોકલ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને ઇમ્યુનોફ્લોરોસન્ટ છબીઓ મેળવવામાં આવી હતી.
HEK293T કોષો સ્થિર રીતે mito-miniSOG ને વ્યક્ત કરતા 15 સેમી ડીશમાં આશરે 30% ની ઘનતા પર સીડ કરવામાં આવ્યા હતા.48 કલાક પછી, જ્યારે ~80% સંગમ થયો, ત્યારે કોષોને PBS વડે એકવાર ધોવામાં આવ્યા, તાજા HBSS બફરમાં 1 mM પ્રોબ 3 સાથે 37°C તાપમાને 1 કલાક માટે ઇન્ક્યુબેટ કરવામાં આવ્યા અને પછી રૂમમાં 10 મિનિટ માટે વાદળી LED વડે પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા. તાપમાન.ત્યારબાદ, કોષોને પીબીએસથી બે વાર ધોવામાં આવ્યા હતા, EDTA-મુક્ત પ્રોટીઝ અવરોધકો (MCE, #HY-K0011) ધરાવતા બરફ-ઠંડા પીબીએસ બફરમાં સ્ક્રેપ કરવામાં આવ્યા હતા અને ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.1 મિનિટ (35% કંપનવિસ્તાર પર 1 સેકન્ડ ચાલુ અને 1 સેકન્ડ બંધ) માટે ટીપને સોનિક કરીને કોષો lysed કરવામાં આવ્યા હતા.પરિણામી મિશ્રણને કાટમાળ દૂર કરવા માટે 4°C પર 10 મિનિટ માટે 15,871 xg પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું, અને BCA પ્રોટીન એસે કીટ (Beyotime, #P0009) નો ઉપયોગ કરીને સુપરનેટન્ટ સાંદ્રતા 4 mg/mL માં ગોઠવવામાં આવી હતી.ઉપરોક્ત 1 મિલી લાઈસેટને 0.1 એમએમ ફોટોડિગ્રેડેબલ બાયોટિન એઝાઈડ (કોન્ફ્લુઅર, #BBBD-14), 1 એમએમ ટીસીઈપી (સાંગોન, #A600974), 0.1 એમએમ ટીબીટીએ લિગાન્ડ (અલાદ્દીન, #T162437), અને 1 એમએમ બોટમ 4 એમએમ ક્યુબીએટર સાથે ભેગું કરો. ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક સુધી પરિભ્રમણ.ત્વરિત પ્રતિક્રિયા પછી, મિશ્રણને 10 મિલી કાચની શીશીમાં પહેલાથી મિશ્રિત દ્રાવણ (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) માં ઉમેરો.નમૂનાઓને ઓરડાના તાપમાને 10 મિનિટ માટે 4500 ગ્રામ પર મિશ્રિત અને સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યા હતા.નીચલા અને ઉપરના ઉકેલો કાઢી નાખવામાં આવ્યા હતા, 1 મિલી મિથેનોલ વડે અવક્ષેપને બે વાર ધોવામાં આવ્યો હતો અને 4°C પર 5 મિનિટ માટે 15871×g પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યો હતો.અવક્ષેપને ઓગળવા માટે 25 એમએમ એમોનિયમ બાયકાર્બોનેટ (ABC, Aladdin, no. A110539) માં 8 M યુરિયા (Aladdin, no. U111902) નું 1 ml ઉમેરો.નમૂનાઓનું પુનઃરચના 10 એમએમ ડિથિઓથ્રેઈટોલ (સાંગોન, #A100281 25 એમએમ એબીસીમાં) સાથે 40 મિનિટ માટે 55 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર કરવામાં આવ્યું હતું અને ત્યારબાદ અંધારામાં ઓરડાના તાપમાને 15 એમએમ તાજા આયોડોસેટામાઈડ (સાંગોન, #A600539) ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.30 મિનિટની અંદર આલ્કિલેશન..પ્રતિક્રિયા રોકવા માટે વધારાના 5 એમએમ ડિથિઓથ્રેઇટોલ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.1 મિલી પીબીએસ વડે 3 વખત ધોઈને પ્રત્યેક નમૂના માટે આશરે 100 μl ન્યુટ્રાએવિડિન એગ્રોઝ મણકા (થર્મો, #29202) તૈયાર કરો.ઉપરોક્ત પ્રોટીઓમ સોલ્યુશન 5 મિલી પીબીએસ સાથે પાતળું કરવામાં આવ્યું હતું અને ઓરડાના તાપમાને 4 કલાક માટે પૂર્વ-ધોવેલા ન્યુટ્રાએવિડિન એગ્રોઝ મણકા સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.ત્યારબાદ મણકાને 0.2% SDS ધરાવતા 5 ml PBS (સાંગોન, #A600485) સાથે 3 વખત, 1M યુરિયા ધરાવતા 5 ml PBS સાથે 3 વખત અને 5 ml ddH2O સાથે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા.ત્યારબાદ મણકાને સેન્ટ્રીફ્યુગેશન દ્વારા કાપવામાં આવ્યા હતા અને 1 M યુરિયા, 1 mM CaCl 2 (મેકલિન, #C805228) અને 20 ng/μl ટ્રિપ્સિન (પ્રોમેગા, #V5280) ધરાવતા 25 mM ABC ના 200 μl માં ફરીથી સસ્પેન્ડ કરવામાં આવ્યા હતા.પરિભ્રમણ સાથે 37°C પર રાતોરાત ટ્રિપ્સિનાઇઝ કરો.pH 2-3 સુધી પહોંચે ત્યાં સુધી ફોર્મિક એસિડ (થર્મો, # A117-50) ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી હતી.મણકાને 0.2% એસડીએસ ધરાવતા 1 મિલી પીબીએસથી 3 વખત, 1 એમ યુરિયા ધરાવતા 1 મિલી પીબીએસ સાથે 3 વખત અને પછી 1 મિલી નિસ્યંદિત પાણીથી 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા.70% MeOH ના 200 μl નો ઉપયોગ કરીને 90 મિનિટ માટે લાઇટ લિસિસ (365 nm) દ્વારા સંશોધિત પેપ્ટાઇડ્સ છોડવામાં આવ્યા હતા.સેન્ટ્રીફ્યુગેશન પછી, સુપરનેટન્ટ એકત્રિત કરવામાં આવ્યું હતું.ત્યારબાદ મણકાને 70% MeOH ના 100 μl સાથે એકવાર ધોવામાં આવ્યા અને સુપરનેટન્ટ્સ એકઠા કરવામાં આવ્યા.નમૂનાઓને સ્પીડવેક વેક્યૂમ કોન્સેન્ટ્રેટરમાં સૂકવવામાં આવ્યા હતા અને પૃથ્થકરણ સુધી -20 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યા હતા.
સિંગલટ ઓક્સિજન મોડિફાઇડ પેપ્ટાઇડ્સને ઓળખવા અને તેનું પ્રમાણ નક્કી કરવા માટે, નમૂનાઓનું 0.1% ફોર્મિક એસિડમાં પુનઃવિસર્જન કરવામાં આવ્યું હતું અને વિક્રેતા સૉફ્ટવેર 4 માંથી Tune અને Xcalibur ના નેનો ESI સ્ત્રોતથી સજ્જ ઓર્બિટ્રેપ ફ્યુઝન લ્યુમોસ ટ્રિબ્રિડ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટરનો ઉપયોગ કરીને 1 μg પેપ્ટાઇડ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.નમૂનાઓને 75 µm × 15 cm આંતરિક રીતે ભરેલા કેશિલરી સ્તંભ પર 3 µm C18 સામગ્રી (ReproSil-pur, #r13.b9.) સાથે અલગ કરવામાં આવ્યા હતા અને EASY-nLC 1200 UHPLC સિસ્ટમ (થર્મો) સાથે જોડાયેલા હતા.પેપ્ટાઈડ્સને લીનિયર 95 મિનિટના ગ્રેડિએન્ટ ક્રોમેટોગ્રાફી દ્વારા 8% દ્રાવક B થી 50% દ્રાવક B (પાણીમાં A = 0.1% ફોર્મિક એસિડ, 80% એસિટોનાઈટ્રાઈલમાં B = 0.1% ફોર્મિક એસિડ), પછી રેખીય રીતે 98% B મિનિટ સુધી વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા. 300 એનએલ/મિનિટના પ્રવાહ દરે 6 મિનિટમાં.ઓર્બિટ્રેપ ફ્યુઝન લુમોસ ડેટાના આધારે સંપૂર્ણ MS સ્કેન અને MS2 સ્કેન વચ્ચે વૈકલ્પિક રીતે ડેટા એકત્રિત કરે છે.સ્પુટરિંગ વોલ્ટેજ 2.1 kV પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું અને આયન ટ્રાન્સપોર્ટ કેશિલરીનું તાપમાન 320°C હતું.MS સ્પેક્ટ્રા (350-2000 m/z) 120,000, AGC 4 × 105, અને મહત્તમ ઇનપુટ સમય 150 ms સાથે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.દરેક સંપૂર્ણ સ્કેનમાં 10 સૌથી સામાન્ય મલ્ટીપ્લાય ચાર્જ કરેલ પૂર્વવર્તી HCD નો ઉપયોગ કરીને 30% ની સામાન્ય અથડામણ ઉર્જા, 1.6 m/z ની ક્વાડ્રપોલ આઇસોલેશન વિન્ડો અને 30,000 ની રિઝોલ્યુશન સેટિંગ સાથે વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા.5×104 અને મહત્તમ ઇનપુટ સમય 150 ms નો ઉપયોગ કરીને ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી માટે AGC લક્ષ્ય.ગતિશીલ અપવાદ 30 સેકન્ડ પર સેટ છે. MS/MS માટે અસાઇન ન કરેલા આયનો અથવા 1+ અને >7+નો ચાર્જ નકારવામાં આવ્યો હતો. MS/MS માટે અસાઇન ન કરેલા આયનો અથવા 1+ અને >7+નો ચાર્જ નકારવામાં આવ્યો હતો. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ અને >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ અને >7+ ના ચાર્જ સાથે અસાઇન કરેલ આયનો અથવા આયનો MS/MS માટે નકારવામાં આવ્યા હતા.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ અને >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS માટે 1+ અને >7+ ના ચાર્જ સાથે અસ્પષ્ટ આયનો અથવા આયનો નકારવામાં આવ્યા હતા.
MSFragger પર આધારિત FragPipe કમ્પ્યુટિંગ પ્લેટફોર્મનો ઉપયોગ કરીને કાચા ડેટાની પ્રક્રિયા કરવામાં આવે છે.માસ પૂર્વગ્રહો અને અનુરૂપ એમિનો એસિડ્સ -150 થી 500 Da ની પૂર્વવર્તી માસ સહિષ્ણુતા સાથે ઓપન સર્ચ અલ્ગોરિધમનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.પીડી (પ્રોટીઓમ ડિસ્કવરર 2.5, થર્મો) માં +229.0964 અને +247.1069 Da ના સામૂહિક લાભ સાથે હિસ્ટીડાઇન ફેરફારોનો ઉપયોગ કરીને સંશોધિત પેપ્ટાઇડ્સને પછી ઓળખવામાં આવ્યા.
6 સે.મી.ની ડીશમાં ફ્યુઝ્ડ મિનીએસઓજી જનીનને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરતા કોષો પ્લેટેડ હતા.~80% સંગમ પર પહોંચ્યા પછી, કોષોને HBSS (Gibco, #14025092) વડે એકવાર ધોવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ HBSS માં રાસાયણિક ચકાસણીઓ સાથે 37°C તાપમાને 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને વાદળી પ્રકાશથી પ્રકાશિત થયા હતા.ઓરડાના તાપમાને 20 મિનિટ માટે 10W LED.PDPL માં કયા પ્રકારની પ્રતિક્રિયાશીલ ઓક્સિજન પ્રજાતિ સામેલ છે તે નિર્ધારિત કરવા માટે, 0.5 mM વિટામિન C (MCE, #HY-B0166), 5 mM ટ્રોલોક્સ (MCE, #HY-101445), D2O (સિગ્મા, #7789-20-0) , 100 mM મન્નિટોલ (એનર્જી કેમિકલ, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 કોષોમાં પૂરક તરીકે ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.ઠંડા પીબીએસ સાથે ધોવા પછી, કોષોને સ્ક્રેપ કરવામાં આવ્યા હતા, 1.5 મિલી સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા, અને EDTA વિના 1x પ્રોટીઝ અવરોધક સાથે PBS ના 200 μl માં 1 મિનિટ માટે ટીપ સાથે સોનિકેટ કરવામાં આવ્યા હતા (1 s અને 1 s વગર, કંપનવિસ્તાર 35%).પરિણામી મિશ્રણને 4 °C પર 10 મિનિટ માટે 15,871 × g પર સેન્ટ્રીફ્યુજ કરવામાં આવ્યું હતું અને BCA પ્રોટીન એસે કીટનો ઉપયોગ કરીને સુપરનેટન્ટ સાંદ્રતા 1 mg/mL માં ગોઠવવામાં આવી હતી.ઉપરોક્ત લાઇસેટમાંથી આશરે 50 μl 0.1 એમએમ રોડામાઇન એઝાઇડ (અલાદ્દીન, નં. T131368), 1 એમએમ ટીસીઇપી, 0.1 એમએમ ટીબીટીએ લિગાન્ડ અને 1 એમએમ ક્યુએસઓ4 સાથે ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે નીચેથી ઉપર સુધી પરિભ્રમણ સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.ક્લિક રિએક્શન પછી, નમૂનાઓમાં 250 μl પ્રી-ચીલ્ડ એસિટોન ઉમેરીને, -20°C પર 20 મિનિટ માટે ઉકાળીને અને 4°C પર 10 મિનિટ માટે 6010×g પર સેન્ટ્રીફ્યુજીંગ કરીને એસિટોન સાથે વરસાદ હાથ ધરવામાં આવ્યો હતો.ગોળી ભેગી કરો અને 1x લેમ્મલીના બફરના 50 µl માં 95 °C તાપમાને 10 મિનિટ માટે ઉકાળો.ત્યારબાદ SDS-PAGE લાંબા જેલ્સ પર નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું અને ઇમેજ લેબ ટચ સોફ્ટવેર સાથે બાયો-રેડ કેમીડોક એમપી ટચ ઇમેજિંગ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવ્યું.
રિકોમ્બિનન્ટ મિનીએસઓજી-6xહિસ પ્રોટીનની અભિવ્યક્તિ અને શુદ્ધિકરણ અગાઉ વર્ણવ્યા પ્રમાણે કરવામાં આવ્યું હતું.સંક્ષિપ્તમાં, E. coli BL21(DE3) કોષો (TransGen, #CD701-02) pET21a-miniSOG-6xHis સાથે રૂપાંતરિત થયા હતા અને પ્રોટીન અભિવ્યક્તિ 0.5 mM IPTG (સાંગોન, #A600168) સાથે પ્રેરિત કરવામાં આવી હતી.સેલ લિસિસ પછી, ની-એનટીએ એગ્રોઝ બીડ્સ (MCE, નંબર 70666) નો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીનને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું, PBS સામે ડાયલાઇઝ કરવામાં આવ્યું હતું, અને -80 °C પર સંગ્રહિત કરવામાં આવ્યું હતું.
એન્ટિબોડી-આધારિત ઇન વિટ્રો લેબલ પ્રોક્સિમિટી એસે માટે, PBS માં 100 μM શુદ્ધિકરણ મિનિએસઓજી, 1 mM પ્રોબ 3, અને 1 μg એન્ટિ-લેબલ માઉસ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (ટ્રાન્સજેન, #HT501-01) ને 50 μl ની કુલ પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમમાં મિક્સ કરો..પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને ઓરડાના તાપમાને 0, 2, 5, 10 અને 20 મિનિટ માટે વાદળી LED લાઇટથી ઇરેડિયેટ કરવામાં આવ્યું હતું.અપવર્ડ મોશન શેકર પર ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે આ મિશ્રણ 0.1 એમએમ બાયોટિન-પીઇજી3-એઝાઇડ (અલાદ્દીન, #B122225), 1 એમએમ ટીસીઇપી, 0.1 એમએમ ટીબીટીએ લિગાન્ડ અને 1 એમએમ ક્યુએસઓ4 સાથે ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.ત્વરિત પ્રતિક્રિયા પછી, મિશ્રણમાં સીધું 4x Laemmli નું બફર ઉમેરો અને 95°C પર 10 મિનિટ માટે ઉકાળો.SDS-PAGE જેલ્સ પર નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને સ્ટ્રેપ્ટાવિડિન-HRP (1:1000, સોલાર્બિયો, #SE068) સાથે પશ્ચિમી બ્લોટિંગ દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
સી-ટર્મિનલ એમિડેશન (LHDALDAK-CONH2) સાથે હિસ્ટીડિન ધરાવતા સિન્થેટીક પેપ્ટાઈડનો ઉપયોગ નજીકના પેપ્ટાઈડ-આધારિત ઇન વિટ્રો લેબલીંગનું વિશ્લેષણ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.આ અભ્યાસમાં, 100 μM શુદ્ધ મિનિએસઓજી, 10 એમએમ પ્રોબ 3 અને 2 μg/ml સિન્થેટિક પેપ્ટાઇડ 50 μl ની કુલ પ્રતિક્રિયા વોલ્યુમમાં પીબીએસમાં મિશ્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.પ્રતિક્રિયા મિશ્રણને ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે વાદળી એલઇડી લાઇટથી ઇરેડિયેટ કરવામાં આવ્યું હતું.LC-MS સિસ્ટમ (MassLynx સ્પેક્ટ્રમ વિશ્લેષણ સોફ્ટવેર સાથે વોટર, SYNAPT XS Ions મોબિલિટી ટાઇમ-ઓફ-ફ્લાઇટ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર) નો ઉપયોગ કરીને નમૂનાના એક માઇક્રોલિટરનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
મિનિએસઓજી ફ્યુઝન જનીનને સ્થિર રીતે વ્યક્ત કરતા HEK293T કોષોને અલગ-અલગ ઓર્ગેનેલ સ્થાનિકીકરણ (મિટો, ER, ન્યુક્લિયસ) સાથે 10 સેમી ડીશમાં અને પાર્કિન-મિનીએસઓજી અને બીઆરડી4-મિનીએસઓજી લાઇન માટે 15 સેમી ડીશમાં સીડ કરવામાં આવ્યા હતા.~90% સંગમ પર પહોંચ્યા પછી, કોષોને HBSS વડે એકવાર ધોવામાં આવ્યા હતા, ત્યારબાદ HBSS માં પ્રોબ 3 સાથે 37°C પર 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા અને ઓરડાના તાપમાને 10 W વાદળી LED સાથે પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યા હતા.પાર્કિનના બિન-સંપર્ક લેબલિંગ માટે, HBSS માં પ્રોબ 3 સાથે 10 µM પ્રોટોન કાર્બોનિલ સાયનાઇડ વાહક m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) 37 °C તાપમાને 1 કલાક માટે ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.સેલ લિસિસ, ક્લિક કેમિસ્ટ્રી, રિડક્શન અને આલ્કિલેશન સ્ટેપ્સ ઉપર વર્ણવ્યા પ્રમાણે જ હતા, સિવાય કે 2 મિલિગ્રામ લાયસેટ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને ફોટોડિગ્રેડેબલ બાયોટિન આઝાઈડને બદલે ક્લિક રિએક્શનમાં બાયોટિન PEG3 આઝાઈડનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.સંવર્ધન પછી, મણકાને 0.2% એસડીએસ ધરાવતા 5 મિલી પીબીએસ સાથે 3 વખત, 1 એમ યુરિયા ધરાવતા 5 મિલી પીબીએસ સાથે 3 વખત અને 5 મિલી પીબીએસ સાથે 3 વખત ધોવામાં આવ્યા હતા.ત્યારબાદ, પ્રોટીનને 37°C પર રાતોરાત સાફ કરવા માટે 300 μl 25 mM ABCમાં 2 µg ટ્રિપ્સિન ઉમેરવામાં આવ્યું હતું જેમાં 1 M યુરિયા હતો.જ્યાં સુધી pH 2-3 ન આવે ત્યાં સુધી ફોર્મિક એસિડ ઉમેરીને પ્રતિક્રિયા બંધ કરવામાં આવી હતી.મણકા પર ટ્રિપ્સિનાઇઝેશન કર્યા પછી, પેપ્ટાઇડ સોલ્યુશનને SOLAµ HRP કૉલમ (થર્મો, #60209-001) નો ઉપયોગ કરીને ડિસેલ્ટ કરવામાં આવ્યું હતું અને તેને સ્પીડવેક વેક્યૂમ કોન્સેન્ટ્રેટરમાં સૂકવવામાં આવ્યું હતું.પેપ્ટાઈડ્સને 0.1% ફોર્મિક એસિડમાં ફરીથી ઓગળવામાં આવ્યા હતા અને ઉપર વર્ણવેલ નેનો-ESI સ્ત્રોતથી સજ્જ ઓર્બિટ્રેપ ફ્યુઝન લ્યુમોસ ટ્રિબ્રિડ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટરનો ઉપયોગ કરીને 500 એનજી પેપ્ટાઈડ્સનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.પેપ્ટાઇડ્સને વ્યાપારી RP-HPLC પ્રીકોલમ્સ (75 μm x 2 cm) (થર્મો, નંબર 164946) અને વિશ્લેષણાત્મક RP-HPLC કૉલમ્સ (75 μm x 25 cm) (થર્મો, નંબર 164941) પર અલગ કરવામાં આવ્યા હતા, બંને 2 μmથી ભરેલા હતા.60 મિનિટમાં 8% થી 35% ACN સુધીનો ઢાળ, પછી 300 Nl/મિનિટના પ્રવાહ દરે 6 મિનિટમાં રેખીય રીતે વધીને 98% B.MS સ્પેક્ટ્રા (350-1500 m/z) 60,000, AGC 4 × 105, અને 50 ms ના મહત્તમ ઇનપુટ સમય સાથે એકત્રિત કરવામાં આવ્યા હતા.30% ની સામાન્ય અથડામણ ઉર્જા, 1.6 m/z ની ક્વાડ્રપોલ આઇસોલેશન વિન્ડો અને 15000 નું રિઝોલ્યુશન સાથે 3 સેકન્ડ ચક્રમાં HCD દ્વારા પસંદ કરેલા આયનોને ક્રમિક રીતે વિભાજિત કરવામાં આવ્યા હતા. 5 × 104 ટેન્ડમ માસ સ્પેક્ટ્રોમીટર AGC લક્ષ્ય અને મહત્તમ ઇન્જેક્શન સમય 22 એમએસનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.ગતિશીલ બાકાત 45 સેકન્ડ પર સેટ છે. MS/MS માટે અસાઇન ન કરેલા આયનો અથવા 1+ અને >7+નો ચાર્જ નકારવામાં આવ્યો હતો. MS/MS માટે અસાઇન ન કરેલા આયનો અથવા 1+ અને >7+નો ચાર્જ નકારવામાં આવ્યો હતો. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ અને >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ અને >7+ ના ચાર્જ સાથે અસાઇન કરેલ આયનો અથવા આયનો MS/MS માટે નકારવામાં આવ્યા હતા.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ અને >7+ были отклонены для МС/МС. MS/MS માટે 1+ અને >7+ ના ચાર્જ સાથે અસ્પષ્ટ આયનો અથવા આયનો નકારવામાં આવ્યા હતા.
ન્યુટ્રાએવિડિન માળખાના સંવર્ધન સુધીના નમૂનાની તૈયારીના પગલાં ઉપર વર્ણવેલ LC-MS/MS વિશ્લેષણમાં સમાન હતા.આશરે 50 μg lysate નો ઉપયોગ લોડિંગ નિયંત્રણ માટે ઇનપુટ તરીકે કરવામાં આવ્યો હતો અને 2 mg lysate નો ઉપયોગ ક્લિક પ્રતિક્રિયાઓ માટે કરવામાં આવ્યો હતો.ન્યુટ્રાવિડિન સાથે સંવર્ધન અને ધોવા પછી, એગ્રોઝ રેઝિન મણકામાં 50 μl લેમ્મલીના બફર ઉમેરીને અને 95° સે. પર 5 મિનિટ માટે ઉકાળીને બાઉન્ડ પ્રોટીનને દૂર કરવામાં આવ્યા હતા.કંટ્રોલ લોડ ઇનપુટ અને મણકો સમૃદ્ધ નમૂનાઓનું SDS-PAGE દ્વારા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને પ્રમાણભૂત પશ્ચિમી બ્લોટ પદ્ધતિઓ દ્વારા PVDF મેમ્બ્રેન (મિલિપોર, #ISEQ00010) માં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યા હતા.0.1% ટ્વીન-20 (TBST) ધરાવતા TBSમાં 5% સ્કિમ મિલ્ક (સાંગોન, #A600669) સાથે પટલને અવરોધિત કરવામાં આવી હતી અને પ્રાથમિક અને ગૌણ એન્ટિબોડીઝ સાથે ક્રમિક રીતે ઉકાળવામાં આવી હતી.પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ TBST માં 5% સ્કિમ મિલ્કમાં 1:1000 ભેળવવામાં આવી હતી અને 4°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવી હતી.ગૌણ એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ 1:5000 ના ગુણોત્તરમાં કરવામાં આવ્યો હતો અને ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યો હતો.કેમિડોક એમપી ઇમેજિંગ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને કેમિલ્યુમિનેસેન્સ દ્વારા પટલની કલ્પના કરવામાં આવી હતી.આકૃતિમાં બ્લોટ્સ અને જેલ્સના તમામ અનકટ સ્કેન કાચા ડેટા તરીકે રજૂ કરવામાં આવ્યા છે.
આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝમાં સસલા વિરોધી SFPQ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (CST, નં. 71992), સસલું વિરોધી FUS મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (CST, નંબર 67840), સસલું વિરોધી NSUN2 પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડી (પ્રોટીનટેક, નંબર 20854-1-) નો સમાવેશ થાય છે. AP), સસલું વિરોધી mSin3A પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડી (Abcam, #ab3479), માઉસ એન્ટિ-ટેગ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (ટ્રાન્સજેન, #HT201-02), માઉસ એન્ટિ-બીટા-એક્ટિન મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (ટ્રાન્સજેન, #HC201-01), સસલું વિરોધી -CDK2 મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (ABclonal, #A0094), રેબિટ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી થી CTBP1 (ABclonal, #A11600), રેબિટ પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડી થી DUT (ABclonal, #A2901), રેબિટ પોલિક્લોનલ એન્ટિબોડી PSMC4 (ABclonal, #A2505), એન્ટિબોડી DNAJB1 પોલીક્લોનલ એન્ટિબોડી (ABclonal, # A5504).આ એન્ટિબોડીઝનો TBST માં 5% સ્કિમ મિલ્કમાં 1:1000 મંદન પર ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.આ અભ્યાસમાં ઉપયોગમાં લેવાતા ગૌણ એન્ટિબોડીઝમાં 1:5000 મંદન પર એન્ટિ-રેબિટ IgG (TransGen, #HS101-01), માઉસ વિરોધી IgG (TransGen, #HS201-01)નો સમાવેશ થાય છે.
BRD4 SFPQ સાથે ક્રિયાપ્રતિક્રિયા કરે છે કે કેમ તેની વધુ તપાસ કરવા માટે, સ્થિર HEK293T અને BRD4-miniSOG કોષો જે HEK293T ને વધારે પડતું એક્સપ્રેસ કરે છે તેને 10 સેમી ડીશમાં પ્લેટેડ કરવામાં આવ્યા હતા.કોષોને ઠંડા પીબીએસથી ધોવામાં આવ્યા હતા અને 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 30 મિનિટ માટે EDTA-મુક્ત પ્રોટીઝ અવરોધક સાથે 1 મિલી પિયર્સ આઇપી લિસિસ બફર (થર્મો ફિશર, #87787) માં લિઝ કરવામાં આવ્યા હતા.તે પછી, લિસેટ્સને 1.5 મિલી સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં એકત્રિત કરવામાં આવ્યા અને 15,871 xg પર 4°C પર 10 મિનિટ માટે સેન્ટ્રિફ્યુજ કરવામાં આવ્યા.સુપરનેટન્ટને 5 µg એન્ટિ-V5 લેબલવાળા માઉસ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (CST, #80076) સાથે રાતોરાત 4°C તાપમાને લણવામાં આવ્યું હતું.લગભગ 50 µl પ્રોટીન A/G ચુંબકીય મણકા (MCE, #HY-K0202) 0.5% ટ્વીન-20 ધરાવતા PBS સાથે બે વાર ધોવા.પછી સેલ લિસેટ્સને નીચેથી ઉપર સુધી પરિભ્રમણ સાથે 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ તાપમાને 4 કલાક માટે ચુંબકીય મણકા સાથે ઉકાળવામાં આવ્યા હતા.પછી મણકાને 1 મિલી પીબીએસટી બફર વડે ચાર વખત ધોવામાં આવ્યા અને 95 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર 5 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવ્યા.SDS-PAGE જેલ્સ પર નમૂનાઓનું વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું અને પ્રમાણભૂત પશ્ચિમી બ્લોટ પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરીને PVDF પટલમાં સ્થાનાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું.ટીબીએસટીમાં 5% સ્કિમ દૂધમાં પટલને અવરોધિત કરવામાં આવી હતી અને પ્રાથમિક અને ગૌણ એન્ટિબોડીઝ સાથે ક્રમિક રીતે ઉકાળવામાં આવી હતી.પ્રાથમિક એન્ટિબોડી રેબિટ એન્ટિ-SFPQ મોનોક્લોનલ એન્ટિબોડી (CST, #71992) TBST માં 5% સ્કિમ મિલ્કમાં 1:1000 ના ગુણોત્તરમાં ઉપયોગમાં લેવાઈ હતી અને 4°C પર રાતોરાત ઉકાળવામાં આવી હતી.એન્ટિ-રેબિટ IgG નો ઉપયોગ 1:5000 ના ગુણોત્તરમાં કરવામાં આવ્યો હતો અને ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવ્યો હતો.કેમિડોક એમપી ઇમેજિંગ સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને કેમિલ્યુમિનેસેન્સ દ્વારા પટલની કલ્પના કરવામાં આવી હતી.
સોલવન્ટ એક્સેસિબલ સરફેસ એરિયા (SASA) વિશ્લેષણ માટે ઉપયોગમાં લેવાતી તમામ રચનાઓ પ્રોટીન ડેટા બેંક (PDB)52 અથવા આલ્ફાફોલ્ડ પ્રોટીન સ્ટ્રક્ચર ડેટાબેઝ53માંથી મેળવવામાં આવી હતી.ફ્રીએસએએસએ પ્રોગ્રામનો ઉપયોગ કરીને દરેક અવશેષો માટે સંપૂર્ણ SASA ની ગણતરી કરવામાં આવી હતી.દરેક માળખા માટે સરેરાશ SASA મેળવવા માટે લેબલ થયેલ હિસ્ટીડિન અને તેના પડોશીઓ માટે માત્ર સંપૂર્ણ અને અસ્પષ્ટ SASA ડેટાનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.દરેક હિસ્ટીડાઇન માટે સંબંધિત દ્રાવક સુલભતા (RSA) ની ગણતરી દ્રાવક માટે ઉપલબ્ધ પ્રાયોગિક મહત્તમ શક્ય અવશેષ સપાટી વિસ્તાર દ્વારા સંપૂર્ણ SASA મૂલ્યને વિભાજીત કરીને કરવામાં આવી હતી.જો સરેરાશ RSA 20% ની નીચે હોય તો તમામ હિસ્ટિડાઇન્સને છુપાયેલા તરીકે વર્ગીકૃત કરવામાં આવ્યા હતા, અન્યથા 56.
ડીડીએ મોડમાં મેળવેલ કાચી ફાઇલોને પ્રોટીઓમ ડિસ્કવરર (v2.5) અથવા MSfragger (ફ્રેગપાઇપ v15.0) નો ઉપયોગ કરીને યોગ્ય સ્વિસપ્રોટ ચકાસાયેલ પ્રોટીન ડેટાબેઝમાં શોધવામાં આવી હતી જેમાં સામાન્ય દૂષકો હોય છે.પેપ્ટાઈડ્સને બે ગુમ થયેલ ક્લીવેજ સાઇટ્સ સાથે સંપૂર્ણ ટ્રિપ્સિનની જરૂર હતી, એક નિશ્ચિત ફેરફાર તરીકે કાર્બામોઈલ મેથિલેશન અને ગતિશીલ ફેરફાર તરીકે મેથિઓનાઈન ઓક્સિડેશન.પ્રિકર્સર અને ફ્રેગમેન્ટ વેઇટ ટોલરન્સ અનુક્રમે 10 ppm અને 0.02 Da (MS2 Orbitrap) પર સેટ કરવામાં આવી હતી. દૂષિત હિટ દૂર કરવામાં આવી હતી, અને <1% ના ખોટા શોધ દર મેળવવા માટે પ્રોટીનને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા. દૂષિત હિટ દૂર કરવામાં આવી હતી, અને <1% ના ખોટા શોધ દર મેળવવા માટે પ્રોટીનને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યા હતા. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного %. દૂષિત હિટ દૂર કરવામાં આવી હતી અને <1% નો ખોટો શોધ દર આપવા માટે પ્રોટીનને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1% 错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружени %1. દૂષિત હિટ દૂર કરવામાં આવી હતી અને <1% નો ખોટો હકારાત્મક દર હાંસલ કરવા માટે પ્રોટીનને ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યું હતું.લેબલનો ઉપયોગ કર્યા વિના જથ્થાત્મક વિશ્લેષણ માટે, ત્રણ જૈવિક પુનરાવર્તનોમાંથી સામાન્ય પ્રોટીન સામગ્રીનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.પ્રોટીન સબસેલ્યુલર સ્થાનિકીકરણ વિશ્લેષણ DAVID બાયોઇન્ફોર્મેટિક્સ રિસોર્સિસ, મિટોકાર્ટા 3.0 અને એલિસ ટિંગ જૂથ દ્વારા સંકલિત અને પ્રકાશિત ડેટાબેસેસમાંથી જીન ઓન્ટોલોજી (GO) વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.જ્વાળામુખીનો નકશો પર્સિયસ (v1.6.15.0) પાસેથી મેળવવામાં આવ્યો હતો. પ્રોટીન વિપુલતા ફોલ્ડ ફેરફારોને બે બાજુવાળા ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય મહત્વ માટે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પ્રોટીન હિટ વિપુલતા ફેરફાર >2 (જ્યાં સુધી અન્યથા જણાવ્યું ન હોય) અને p મૂલ્ય <0.05 સાથે ઓળખવામાં આવ્યા હતા. પ્રોટીન વિપુલતા ફોલ્ડ ફેરફારોને બે બાજુવાળા ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને આંકડાકીય મહત્વ માટે પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પ્રોટીન હિટ વિપુલતા ફેરફાર >2 (જ્યાં સુધી અન્યથા જણાવ્યું ન હોય) અને p મૂલ્ય <0.05 સાથે ઓળખવામાં આવ્યા હતા. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. પ્રોટીન સામગ્રીના ફોલ્ડ ફેરફારોનું આંકડાકીય મહત્વ માટે ટુ-ટેલ્ડ ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું હતું, અને પ્રોટીન મેચોને સામગ્રી ફેરફાર >2 (સિવાય કે નોંધ્યું ન હોય) અને એપી મૂલ્ય <0.05 સાથે ઓળખવામાં આવ્યા હતા.使用 双边 t 检验 测试 蛋白质 丰度 倍数 变化 的 统计 显着性 ， 并 确定 蛋白质 命 命 中 丰度 变化> 2 （除非 另 有 说明 和 和 P 值双边 双边 t 检验 测试 蛋白质 倍 数 变化 的 统计 显着性 并 确定 蛋白质 命 中 中 的 丰度> 2 （另 有 说明 和 和 P 值 Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. પ્રોટીન સામગ્રીમાં ફોલ્ડ ફેરફારોનું આંકડાકીય મહત્વ દ્વિ-પૂંછડીવાળા ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને ચકાસવામાં આવ્યું હતું, અને સામગ્રીના ફેરફારો >2 (જ્યાં સુધી અન્યથા સૂચવવામાં ન આવે ત્યાં સુધી) અને p-મૂલ્યો <0.05 માટે પ્રોટીન મેચો નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.સ્ટ્રીંગ ડેટાબેઝ સાથે GO વિશ્લેષણનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન ક્રિયાપ્રતિક્રિયા વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.
સમાન પરિણામો સાથે ત્રણ જૈવિક પ્રતિકૃતિઓ હાથ ધરવામાં આવી હતી.આંકડાકીય વિશ્લેષણ ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ (ગ્રાફપેડ સૉફ્ટવેર) સાથે કરવામાં આવ્યું હતું અને પર્સિયસ (v1.6.15.0) સાથે જ્વાળામુખી પ્લોટ બનાવવામાં આવ્યા હતા.બે જૂથોની સરખામણી કરવા માટે, પી-મૂલ્યો બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટનો ઉપયોગ કરીને નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.પ્રાયોગિક જૂથમાં ઓછામાં ઓછા બે વખત ઓળખવામાં આવેલા માત્ર સિંગલટન પ્રોટીનને જ જ્વાળામુખીના પ્લોટમાં સામેલ કરવામાં આવ્યા હતા, અને નિયંત્રણ જૂથમાં અનુરૂપ ગુમ થયેલ મૂલ્યોને સામાન્ય વિતરણમાંથી પર્સિયસ સાથે બદલવામાં આવ્યા હતા જેથી કરીને p-મૂલ્યની ગણતરી કરી શકાય.ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.આંકડાકીય વિશ્લેષણ માટે પ્રોટીઓમિક વિશ્લેષણમાં, પ્રોટીનની વિપુલતા જે ઓછામાં ઓછી બે જૈવિક પ્રતિકૃતિઓમાં દેખાય છે તે જાળવી રાખવામાં આવી હતી.નમૂનાનું કદ પૂર્વ-નિર્ધારિત કરવા માટે આંકડાકીય પદ્ધતિઓનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો ન હતો.પ્રયોગો રેન્ડમ નથી.પ્રયોગ અને પરિણામોના મૂલ્યાંકન દરમિયાન સંશોધકો કાર્યો પ્રત્યે આંધળા ન હતા.
અભ્યાસ ડિઝાઇન પર વધુ માહિતી માટે, આ લેખ સાથે જોડાયેલ નેચર રિસર્ચ રિપોર્ટ અમૂર્ત જુઓ.
આ અભ્યાસમાં મેળવેલ માસ સ્પેક્ટ્રોમેટ્રી ડેટા ડેટાસેટ ID PXD034811 (PDPL-MS ડેટાસેટ) હેઠળ iProX57 પાર્ટનર રિપોઝીટરી મારફતે ProteomeXchange Consortium ને સબમિટ કરવામાં આવ્યો હતો.કાચો ડેટા કાચા ડેટા ફાઇલોના સ્વરૂપમાં પ્રદાન કરવામાં આવે છે.આ લેખ મૂળ ડેટા પ્રદાન કરે છે.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. પડોશને જાણવું: પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ અને મેપ ઓર્ગેનેલ્સને લાક્ષણિકતા આપવા માટે નિકટતા-આધારિત બાયોટિનીલેશનનો ઉપયોગ કરવો. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. પડોશને જાણવું: પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ અને મેપ ઓર્ગેનેલ્સને લાક્ષણિકતા આપવા માટે નિકટતા-આધારિત બાયોટિનીલેશનનો ઉપયોગ કરવો.Gingras, AS, Abe, KT અને Raut, B. આસપાસના વાતાવરણ સાથે પરિચિતતા: પ્રોટીન કોમ્પ્લેક્સ અને મેપ ઓર્ગેનેલ્સની લાક્ષણિકતા માટે નિકટતા-આધારિત બાયોટિનીલેશનનો ઉપયોગ. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物蛋白质复合物蛋白质复合物素化来表征蛋白质复合牘廩年店 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. પડોશીને સમજવું: જૈવિક જીવન પર પડોશીની અવલંબનનો ઉપયોગ કરો.Gingras, AS, Abe, KT અને Raut, B. નિકટતાની સમજણ: પ્રોક્સિમિટી-આશ્રિત બાયોટિનીલેશનનો ઉપયોગ કરીને પ્રોટીન સંકુલનું પાત્રાલેખન અને ઓર્ગેનેલ્સના મેપિંગ.વર્તમાન.મારો અભિપ્રાય.કેમિકલ.જીવવિજ્ઞાન 48, 44–54 (2019).
ગેરી, જેબી એટ અલ.ડેક્સ્ટર ઊર્જાને રોગપ્રતિકારક કોષોમાં સ્થાનાંતરિત કરીને માઇક્રોએનવાયરમેન્ટનું મેપિંગ.વિજ્ઞાન 367, 1091–1097 (2020).
હર્ટલિંગ, EL એટ અલ.બે-પ્રોટીઓમ સ્કેલ નેટવર્ક્સ માનવ ઇન્ટરેક્ટોમના સેલ-વિશિષ્ટ રિમોડેલિંગને શોધી કાઢે છે.કોષો 184, 3022–3040.e3028 (2021).